一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，包括如下步骤：S1.蛋清肽的提取：(1)灭酶；(2)碱性蛋白酶酶解；(3)风味蛋白酶酶解；(4)活性炭吸附；S2.蛋清肽的分离纯化：(1)超滤(2)冻干；S3.葡聚糖凝胶层析，得到能促皮肤创面愈合的蛋清肽，于‑20℃保存。本发明专利技术以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH 11和55℃、pH 7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果，具有广阔的应用前景。

A protein peptide that can promote skin wound healing and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法。
技术介绍
食源性多肽是以食用蛋白为原料，经酶解、分离、纯化得到蛋白肽，按照来源的不同可分为动物源肽和植物源肽两大类。目前，在动物源肽的研究方向主要集中于乳蛋白肽、胶原蛋白肽和蛋清蛋白肽等；植物源肽的研究则以大豆肽、玉米肽等为主。而根据分子量大小的差异，又可以将食源性肽分为低聚肽(小于1kDa)和多肽(大于1kDa)。通常食源性多肽的长度约为3～20个氨基酸，包括疏水氨基酸残基和赖氨酸、脯氨酸以及精氨酸等亲水氨基酸残基。这些多肽可能具备除满足人体系统正常营养以外的某些生物调节功能。当人体消化食物时，来源于这些食物的食源性多肽可能会影响到心血管、消化、神经和免疫系统等重要身体系统的功能。近年来，研究表明，许多食源性多肽具有相似的生物活性，如抗菌、抗氧化、抗血栓、抗高血压降血脂、促消化和免疫调节活性等。不同种肽其特殊的序列组成产生了不同的生物活性[2]。此外，相较于化学药物，食源性多肽对人体毒性更小，副作用更少，安全性更高，并且其制备成本更低。蛋清蛋白的水解产物具有多种功能特性。单独或组合应用不同的酶水解蛋清粉，可以得到多种不同的酶解产物。在过去的几十年中，科研人员已经通过胃蛋白酶，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等开发并标记了很多有益身体健康效果的功能性多肽。蛋清粉经由嗜热菌蛋白酶水解获得了可抑制ACE活性的生物活性肽。包含Tyr-Arg-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu、Arg-Ala-AspHis-Pro-Phe-Leu和Ile-Val-Phe氨基酸序列的多肽具有强烈的ACE抑制剂功能。对自发性高血压大鼠给药处理，与对照组相比可有效降低大鼠的血压。Fujita等用胃蛋白酶，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶水解卵白蛋白并产生7种ACE抑制肽：LKA，LKP，LAP，IKW，FQKPKR，FKGRYYP和IVGRPRHQG。清蛋白分解产生一些具ACE抑制作用的多肽，并且这些多肽能够降低血脂含量。这些来自蛋清和卵清蛋白的多肽还对血管舒张有效。来自卵转铁蛋白的肽具有非常好的抗微生物活性和抗氧化性。不过水解后的卵转铁蛋白丧失了结合铁的能力。研究人员利用复合蛋白酶，碱性蛋白酶，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等处理卵转铁蛋白，得到能够保护人体白细胞免受氧化损伤(包括DNA损伤)的酶解产物。含Lys-Val-Arg-Glu-Gly-Thr肽序列的卵转铁蛋白水解产物也具有强烈的ACE抑制活性和血管舒张活性。研究表明，卵类粘蛋白酶解得到的小肽对T细胞的具有免疫调节活性，卵粘蛋白小肽具有体外巨噬细胞刺激活性。合成的卵粘蛋白肽也显示出免疫调节活性，诱导T细胞分泌细胞因子白细胞介素(IL)-4，IL-10，IL-13，干扰素(IFN)γ和IL-6。目前，国内工业化规模水解蛋白几乎都是采用间歇式直接加酶的生产方式，首先蛋白质底物与酶在反应器中水解，当到达预期的水解度后，钝化酶，再通过盐析或者膜分离的方法分离出多肽。间歇式生产有很多不足之处：①由于酶的一次性使用，生产成本高；②反应体系中反应程度难于控制，造成了各批次间产品分子组成的差异；③反应结束后，需改变水解条件或热处理钝化酶，增加了费用；④劳动强度大，需要投入大量劳力，人工费用高；⑤由于反应的起动与终止，生产效率低；⑥由于反应体系中底物浓度的抑制，导致反应速度慢，产品转化率偏低。公开号为“CN101724675A”公开了一种蛋清蛋白多肽的制备工艺，该工艺将蛋清匀浆后进行第一次酶解，然后用β-环糊精包裹，接着进行第二次酶解，最后进行吸附、过滤、真空干燥，制得无苦味的蛋清蛋白多肽粉。该方法的缺陷同样是采用间歇式直接加酶的方法制备多肽，用量酶大，成本高，工业上应用前景较低。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术提供一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法，其目的在于，提供一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽，通过以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH11和55℃、pH7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果。本专利技术提供一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，包括如下步骤：S1.蛋清肽的提取：(1)灭酶：称取蛋清粉溶解于双蒸水中，充分搅拌使其溶解后，置于90℃恒温水浴锅中，不断搅拌，水浴10min，以达到灭酶的蛋清液A；(2)碱性蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液A温度降至到60℃左右，置于50℃恒温水浴锅中，pH调至11，加入Alcalase碱性蛋白酶酶解4h，完成后，沸水浴10min对蛋白液灭酶，得到灭酶的蛋清液B；(3)风味蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液B降至55℃后，置于55℃恒温水浴锅中，调节pH为7，加入5％风味蛋白酶,反应4h，结束后，再次沸水浴10min灭酶，得到灭酶的蛋清液C；(4)活性炭吸附：待灭酶的蛋清液C温度降至室温，加入活性炭静置2h，纱布过滤后，离心15min，收集上清，得到酶解液，放置在-20℃保存；S2.蛋清肽的分离纯化：(1)超滤：将步骤S1得到的酶解液稳定通过超滤系统，保留含有分子量小于1kDa的小分子蛋清肽的超滤液，于-20℃保存；(2)冻干：将超滤获得的小分子蛋清肽超滤液，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉；S3.葡聚糖凝胶层析：将步骤S2得到的冻干粉按比例溶于双蒸水中，通过葡聚糖凝胶层析分离得到的一系列蛋清肽组分，选择其中保留时间为100-120min的组分，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉，得到能促皮肤创面愈合的蛋清肽，于-20℃保存。作为本专利技术进一步的改进，步骤S1中所述Alcalase碱性蛋白酶的质量浓度为5wt％，所述离心转速为7000-7500r/min，所述活性炭含水量为2-5％。作为本专利技术进一步的改进，步骤S3中所述葡聚糖凝胶为SephadexG-15凝胶。作为本专利技术进一步的改进，步骤S3中所述葡聚糖凝胶层析的流动相为双蒸水，流速为1.4mL/min。作为本专利技术进一步的改进，步骤S3中所述葡聚糖凝胶层析中采用紫外检测仪检测洗脱液吸光度，得到不同分子量大小范围的吸收峰。作为本专利技术进一步的改进，所述紫外检测仪选择280nm处检测吸光度值。本专利技术进一步保护一种根据上述制备方法制得的蛋清肽。本专利技术进一步保护一种能促进皮肤创面愈合的组合物，包括上述蛋清肽。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH11和55℃、pH7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果，具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术测试例1中蛋清肽对小鼠伤口愈合的影响图；图2为本专利技术实施例1制得的蛋清肽的葡聚糖凝胶层析图谱。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.蛋清肽的提取：(1)灭酶：称取蛋清粉溶解于双蒸水中，充分搅拌使其溶解后，置于90℃恒温水浴锅中，不断搅拌，水浴10min，以达到灭酶的蛋清液A；(2)碱性蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液A温度降至到60℃左右，置于50℃恒温水浴锅中，pH调至11，加入Alcalase碱性蛋白酶酶解4h，完成后，沸水浴10min对蛋白液灭酶，得到灭酶的蛋清液B；(3)风味蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液B降至55℃后，置于55℃恒温水浴锅中，调节pH为7，加入5％风味蛋白酶,反应4h，结束后，再次沸水浴10min灭酶，得到灭酶的蛋清液C；(4)活性炭吸附：待灭酶的蛋清液C温度降至室温，加入活性炭静置2h，纱布过滤后，离心15min，收集上清，得到酶解液，放置在‑20℃保存；S2.蛋清肽的分离纯化：(1)超滤：将步骤S1得到的酶解液稳定通过超滤系统，保留含有分子量小于1kDa的小分子蛋清肽的超滤液，于‑20℃保存；(2)冻干：将超滤获得的小分子蛋清肽超滤液，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉；S3.葡聚糖凝胶层析：将步骤S2得到的冻干粉按比例溶于双蒸水中，通过葡聚糖凝胶层析分离得到的一系列蛋清肽组分，选择其中保留时间为100‑120min的组分，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉，得到能促皮肤创面愈合的蛋清肽，于‑20℃保存。...

【技术特征摘要】
1.一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.蛋清肽的提取：(1)灭酶：称取蛋清粉溶解于双蒸水中，充分搅拌使其溶解后，置于90℃恒温水浴锅中，不断搅拌，水浴10min，以达到灭酶的蛋清液A；(2)碱性蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液A温度降至到60℃左右，置于50℃恒温水浴锅中，pH调至11，加入Alcalase碱性蛋白酶酶解4h，完成后，沸水浴10min对蛋白液灭酶，得到灭酶的蛋清液B；(3)风味蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液B降至55℃后，置于55℃恒温水浴锅中，调节pH为7，加入5％风味蛋白酶,反应4h，结束后，再次沸水浴10min灭酶，得到灭酶的蛋清液C；(4)活性炭吸附：待灭酶的蛋清液C温度降至室温，加入活性炭静置2h，纱布过滤后，离心15min，收集上清，得到酶解液，放置在-20℃保存；S2.蛋清肽的分离纯化：(1)超滤：将步骤S1得到的酶解液稳定通过超滤系统，保留含有分子量小于1kDa的小分子蛋清肽的超滤液，于-20℃保存；(2)冻干：将超滤获得的小分子蛋清肽超滤液，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉；S3.葡聚糖凝胶层析：将步骤S2得到的冻干粉按比例溶于双蒸水中，通过葡聚糖凝胶层析分离得到的一系列...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜轶群，刘静波，张婷，李艳菊，杨海霞，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22