本发明专利技术提供FCHO2基因在制备宫颈癌放疗增敏药物的应用，将FCHO2基因RNAi慢病毒转染宫颈癌细胞后再放疗，能够抑制细胞增殖、细胞周期阻滞及促进细胞凋亡，具有靶向宫颈癌放射敏感性的作用。本发明专利技术提供了FCHO2基因和抑制或下调FCHO2基因表达的试剂的应用,能够有效提高宫颈癌肿瘤细胞的放疗敏感性。
Application of FCHO2 gene in preparation of radiosensitizer for cervical cancer
【技术实现步骤摘要】
FCHO2基因在制备宫颈癌放疗增敏药物的应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及FCHO2基因在制备宫颈癌放疗增敏药物的应用。
技术介绍
肿瘤放疗增敏药物：放射治疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。放射增敏药物是一种化学或药物制剂，当与放射治疗同时应用时可以改变肿瘤细胞对放射的反应性，从而增加对肿瘤细胞的杀伤效应。放射增敏是指为增强射线对肿瘤细胞的杀伤效应，提高肿瘤的控制率和治愈率。在分子生物学指导下提高肿瘤对射线的敏感性以及改善放射抗拒肿瘤的放射效果是放疗发展新趋势，放疗正从“物理精确”走向“生物精准”。宫颈癌是我国女性生殖道二大恶性肿瘤之首，尤其是近年来出现全球发病年轻化趋势，严重威胁着广大妇女的健康。其中Ⅱb期以上中晚期患者众多，其治疗手段主要采用以放疗为主的综合治疗。放射治疗是中晚期宫颈癌中的主要治疗手段，体外照射联合腔内近距离放疗是公认的放疗模式。接受单纯放疗的Ⅱb-Ⅳ期患者的5年生存率在50％-70％和30％-50％之间。尽管近年来放疗新技术不断取得进步，放化疗及靶向的新药物为宫颈癌患者带来新的希望，但宫颈癌根治性放疗为主的综合治疗疗效并未有明显改善。目前同步放化疗为中晚期宫颈癌标准治疗方案，宫颈癌细胞本身基因特性导致其临床效果差异很大，其中宫颈癌细胞的放射敏感性与其细胞分化程度、细胞周期、临床分期和解剖大体分型等诸多因素有关，特别肿瘤的基因表型。随着分子生物学的发展，研究者从分子水平上阐述了宫颈癌的发病机制，发现多个基因分子水平的变化与宫颈癌的发生、发展密切相关，在宫颈癌的放疗反应中起着重要作用。人们试图从基因水平寻找对辐射敏感的放疗靶点，以最高效的杀灭肿瘤，同时最大限度地保护正常组织，从而提高放疗效果，减少放疗副作用。尽管目前研究很多，但临床仍未有高级别循证医学证据的放疗增敏药物。需要进一步筛选与验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提FCHO2基因在制备宫颈癌放疗增敏药物的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：通过表达谱芯片筛从宫颈癌根治性放疗临床标本中筛选出宫颈鳞癌放疗敏感性基因，进一步通过高通量慢病毒高内涵（HCS）细胞筛选实验方法，通过比较基因敲减放疗处理前后细胞增殖速度的影响，在待检目的基因中初步筛选出放疗后增殖抑制表型明显的FCHO2基因。制备FCHO2放射敏感性基因RNAi慢病毒的药物，从而提高宫颈癌的放射敏感性，进而提高肿瘤的局控率及生存率。本专利技术的优点在于：FCHO2基因RNAi慢病毒载体的设计、构建，本专利技术将FCHO2基因RNAi慢病毒转染宫颈癌细胞后再放疗，能够抑制细胞增殖、细胞周期阻滞及促进细胞凋亡，具有靶向宫颈癌放射敏感性的作用。本专利技术提供了FCHO2基因和抑制或下调FCHO2基因表达的试剂的新应用，能够有效提高宫颈癌肿瘤细胞的放疗敏感性。附图说明图1工具载体图谱。图2线性化载体电泳图。其中泳道1：1kbMarker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：AgeI和EcoRI双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒。图3PCR扩增电泳图，泳道1：阴性对照（ddH2O），排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果，泳道2：自连对照（空载体自连对照组）；泳道3：250bpMarker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：单克隆psc56975-1,2,3,4,5。图4流式细胞仪检测FCHO2基因消减对凋亡的影响。相比shCtrl-W组，shFCHO2-W组凋亡数无显著差异(P>0.05)，相比shCtrl-F组，shFCHO2-F组凋亡数增多(P<0.05)。图5流式细胞仪检测FCHO2基因消减对细胞周期的影响。相比shCtrl-W组，shFCHO2-W组处于S期、G1期、G2/M期的细胞均无显著变化；相比shCtrl-F组，shFCHO2-F组处于S期的细胞增多(P<0.05)，处于G1期的细胞无显著变化，G2/M期的细胞减少(P<0.05)。图6MTT检测FCHO2基因消减对细胞增殖的影响。相比shCtrl-W组，shFCHO2-W组细胞增殖无显著差异（P＞0.05）；相比shCtrl-F组，shFCHO2-F组细胞增殖减缓（P<0.05）。图7WesternBlot检测靶点降低FCHO2基因蛋白表达水平；柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差（SD），**,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比，P<0.01；*,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比，0.01<P<0.05。具体实施方式实施例1以FCHO2基因为模板，设计RNA干扰靶点序列，构建目的基因RNA干扰慢病毒载体。1．实验质粒：载体编号：GV115，元件顺序：hU6-MCS-CMV-EGFP，对照插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT；工具载体图谱如图1所示。2.RNA干扰靶点设计根据RNA干扰序列设计原则，以FCHO2基因为模板，设计多个19-21ntRNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。3.DNAoligo序列合成根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNAoligo。＊CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。4.FCHO2基因RNAi慢病毒载体构建和包装：按实验手册进行。4.1线性化载体制备按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化。37℃（最适温度）反应1h，之后切胶回收目的片段。琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。4.2RNA干扰慢病毒载体构建(1)连接按照FermentasT4DNALigase说明书配制20μl反应体系，将双链DNAoligo与线性化的载体相连。于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc56975，之后进行转化实验。（2）转化将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：将10μl连接产物psc56975加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。42℃热激90sec，冰浴2min。加入500µL无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1hr。取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。（3）阳性克隆的PCR鉴定（3.1）引物（3.2）PCR扩增按下表配制20μlPCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。PCR结束后，取5μl产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带。琼脂糖凝胶电泳图片如图3所示。PCR条带大小：连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：341bp；没有连接入shRNA片段的空载本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.FCHO2基因在制备宫颈癌放疗增敏药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.FCHO2基因在制备宫...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅志超，王凤玫，蔡建明，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区福州总医院，
类型：发明
国别省市：福建,35
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