一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO及其制备方法与应用技术

一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D‑cGO，是由N‑异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）、HE‑壳聚糖、D‑cGO通过自由基聚合反应以接枝反应制得。本发明专利技术利用聚（N‑异丙基丙烯酰胺）的温敏性，D‑cGO的多活性片层结构，以及HE‑壳聚糖优越的物理化学性质，通过简单的自由基聚合反应以及接枝反应得到的一种新型的微凝胶。该双功能型微凝胶兼具温度响应性以及良好机械性，具有良好的生物相容性。人骨髓间充质干细胞（hMSCs）依托于双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D‑cGO的支架环境中，通过调控温度，实现溶胶‑凝胶的转变，成功地进行干细胞的3D培养。

A bifunctional microgel PNIPAM/HECs/D-cGO and its preparation and Application

A bifunctional microgel PNIPAM/HECs/D, cGO, is prepared by graft polymerization of N isopropyl acrylamide (NIPAAm), HE chitosan and D cGO cGO by radical polymerization. The present invention utilizes the thermal sensitivity of poly (N isopropylacrylamide), the multi active lamellar structure of D cGO, and the excellent physicochemical properties of HE chitosan, and a new microgel obtained through simple radical polymerization and graft reaction. The bifunctional microgel has good temperature response and good mechanical properties, and has good biocompatibility. Human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) rely on the scaffold environment of bifunctional microgel PNIPAM/HECs/D (cGO) to achieve the change of sol gel by adjusting the temperature, and successfully develop 3D culture of stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医学材料
具体涉及一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO及其制备方法与应用。
技术介绍
聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）是由单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）交联聚合，产生的一种温敏可逆水凝胶。在其LCST前后，可进行亲水溶胀或疏水收缩。同时，它与人体有着良好的生物相容性[JournalofPolymerResearch(2018)25:19]。HE-壳聚糖是将羟乙基添加至壳聚糖，进而改善其水溶性[SHAOetal./J.OceanUniv.China(OceanicandCoastalSeaResearch)201514:703-709]。目前，由于HECs优越的物理化学性质，以及生物相容性和生物降解性，已被广泛应用于医药载体、组织工程等生物材料。实验室成功获得了制备HE-壳聚糖的快捷制备方法，生物相容性好，可以用于组织工程领域[专利公布号：CN108478874A]。D-cGO为氧化石墨烯（GO）的多功能衍生物，通过选用二硫苏糖醇（DTT）交联GO网络，增强其表面活性以及分散性。而且，可有效提高纳米复合水凝胶的机械性能[ACSAppl.Mater.Interfaces2015,7,3003−3008]。人骨髓间充质干细胞（hMSCs）是一类具有强大增殖能力和多向分化潜能的多能干细胞，被广泛应用于细胞工程、再生医学、细胞治疗和组织工程等领域。近年来，有大量的研究聚焦于构建三维支架体系，用于干细胞的3D培养。与2D相比，3D平台将更好地模拟人体内的微环境[Molecules2018,23,553]。从而，明显地改善细胞产量，防止细胞聚集，有利于细胞生长和增殖。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO，同时提供其制备方法及应用是本专利技术的又一专利技术目的。基于上述目的，本专利技术采取如下技术方案：一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO，是由N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）、HE-壳聚糖（HECs）、D-cGO通过自由基聚合反应以接枝反应制得。所述的双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO的制备方法，包括以下步骤：1）D-cGO的制备：将氧化石墨烯溶于去离子水中，超声处理后，加入二硫苏糖醇（DTT）溶液，加热搅拌制得D-cGO溶液；2）PNIPAM/HECs的制备：以1%的乙酸溶液为溶剂，HECs和NIPAAM在交联剂、引发剂以及催化剂的协助下反应得到复合物PNIPAM/HECs；3）PNIPAM/HECs/D-cGO的制备：将D-cGO溶液和复合物PNIPAM/HECs在0℃下反应制得双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO。所述D-cGO的制备过程为：将4mg氧化石墨烯溶于（4～6）ml去离子水中，低温冰浴超声2～3h，加入0.58ml二硫苏糖醇（DTT）溶液并在85～90℃下搅拌30～35min，制得D-cGO。所述PNIPAM/HECs复合物的制备过程为：a）在氮气氛围中，先将HECs加入50ml1wt%的乙酸溶液中并于400～450rpm下搅拌混合20～30min；再加入NIPAAm500～600rpm下搅拌30～40min，之后依次加入交联剂MBA0.00021mol、引发剂APS0.00014mol以及催化剂SBS0.00014mol，于50～80℃下搅拌3～8h结束反应，冷却至室温，搅拌速度为400rpm～600rpm；b）反应液在6000rpm～9000rpm下离心15min，除去上清液，保留底部胶体，向离心管中加入30ml的超纯水后，将其转移至透析袋中（Mw=7000），每天定期更换两次水，透析5～6天；c）将透析产物在35～45℃下进行旋蒸，得到PNIPAM/HECs复合物。所述NIPAAm、MBA、APS、SBS的摩尔比为1：1.5%：1%：1%；所述NIPAAm与HECs的质量比为（2～20）：1。所述PNIPAM/HECs/D-cGO微凝胶的制备过程为：A.将PNIPAM/HECs复合物在-20℃下冷冻48～50h后，再转移至真空冷冻干燥机冷冻干燥48～50h，得到冻干的PNIPAM/HECs固体；B.将PNIPAM/HECs中加入去离子水中在0℃下搅拌2h～3h；同时将D-cGO溶液超声处理2h～3h；之后二者在0℃下搅拌使其充分反应，制得PNIPAM/HECs/D-cGO；反应体系中，D-cGO溶液的质量浓度为0.005～0.01wt%，且PNIPAM/HECs复合物与D-cGO的质量比为500：1～50：1。所述的双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO在干细胞3D培养过程中的应用。本专利技术是利用聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）的温敏性，D-cGO的多活性片层结构，以及HE-壳聚糖优越的物理化学性质，通过简单的自由基聚合反应以及接枝反应得到的一种新型的微凝胶，兼具温度响应性，以及良好机械性的双功能型微凝胶；所获得的双功能型微凝胶具有良好的生物相容性，成功地进行了干细胞的3D培养。本专利技术中使用的HECs为羟乙基壳聚糖，其制备方法参见专利公布号：CN108478874A的记载。与现有技术相比，本专利技术的优势在于：（1）通过对温度的简单调控即可实现溶胶-凝胶的转变，现象明显且易于进行细胞装载；（2）HE-壳聚糖为壳聚糖的水溶性衍生物，具有良好的生物相容性和生物降解性；（3）D-cGO为氧化石墨烯（GO）的多功能衍生物，提高传统复合水凝胶的机械性能；（4）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）采用3D培养系统，细胞分布均匀，更有利于细胞的生长和扩散增殖；（5）本专利技术使用的D-cGO未见文献报道，且未见文献报道将HE-壳聚糖用于复合水凝胶的制备；（6）本专利技术双功能型微凝胶制备过程步骤简单，可操作性强，将有利于实现本专利技术在生物医用不同领域的推广与应用。附图说明图1为在25℃（左）和37℃（右）水凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO的溶胶-凝胶实物图；图2为制得的水凝胶（a）PNIPAM（b）PNIPAM/HECs（c）PNIPAM/HECs/D-cGO的FTIR图；图3为制得的D-cGO的TEM图；图4为制得的水凝胶（a）PNIPAM/HECs（b）PNIPAM/HECs/D-cGO冻干后的SEM图；图5为双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO装载细胞后经DAPI和鬼笔环肽染色后的激光共聚焦图（a）DAPI通道照片；（b）鬼笔环肽通道照片；（c）复合照片。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步描述。实施例1一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO，是由N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）、HE-壳聚糖（HECs）、D-cGO通过自由基聚合反应以接枝反应制得。所述的双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO的制备方法，包括以下步骤：1）D-cGO的制备：将氧化石墨烯溶于去离子水中，超声处理后，加入二硫苏糖醇（DTT）溶液，加热搅拌制得D-cGO溶液；所述D-cGO的制备过程为：将4mg氧化石墨烯溶于4ml去离子水中，低温冰浴超声3h，加入0.58m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D‑cGO，其特征在于，是由N‑异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）、HE‑壳聚糖（HECs）、D‑cGO通过自由基聚合反应以接枝反应制得。

【技术特征摘要】
1.一种双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO，其特征在于，是由N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）、HE-壳聚糖（HECs）、D-cGO通过自由基聚合反应以接枝反应制得。2.权利要求1所述的双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）D-cGO的制备：将氧化石墨烯溶于去离子水中，超声处理后，加入二硫苏糖醇（DTT）溶液，加热搅拌制得D-cGO溶液；2）PNIPAM/HECs的制备：以1%的乙酸溶液为溶剂，HECs和NIPAAM在交联剂、引发剂以及催化剂的协助下反应得到复合物PNIPAM/HECs；3）PNIPAM/HECs/D-cGO的制备：将D-cGO溶液和复合物PNIPAM/HECs在0℃下反应制得双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO。3.如权利要求2所述的双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO的制备方法，其特征在于，所述D-cGO的制备过程为：将（4～6）mg氧化石墨烯溶于（4～6）ml去离子水中，低温冰浴超声2～3h，加入0.58ml二硫苏糖醇（DTT）溶液并在85～90℃下搅拌30～35min，制得D-cGO。4.如权利要求2所述的双功能型微凝胶PNIPAM/HECs/D-cGO的制备方法，其特征在于，所述PNIPAM/HECs复合物的制备过程为：a）在氮气氛围中，先将HECs加入50ml1wt%的乙酸溶液中并于400～450rpm下搅拌混合20～30min；再加入NIPAAm500～600rpmrpm下搅拌30～40...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂磊，李洁，曹佩玉，董婧，孙萌，袁红雨，韩艳婷，陈世锋，
申请(专利权)人：信阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41