一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，属于生物工程领域。在热凝胶发酵液中，微生物菌体包裹在不溶性的热凝胶内，很难将两者分离开来。为在工业规模下获得低含氮量的高品质热凝胶产品，需分离去除微生物菌体。本发明专利技术对热凝胶发酵液进行第一次压滤后的固形物进行处理，将之溶解于碱性溶液中，进而采用均质法使内含的不溶性胶质物完全溶解，采用中性红和苯胺蓝进行染色和显微镜观察和检验，确保碱溶后不含有不溶性胶质物，能够显著提高后续压滤速率和除菌率，从而有益于工业规模下提高热凝胶最终产品的品质。

A method for removing fungal cells from hot gel fermentation broth

The invention discloses a method for removing fungal cells from a hot gel fermentation liquid, belonging to the field of bioengineering. In hot gel fermentation broth, microorganism is wrapped in insoluble hot gel, so it is difficult to separate them. In order to obtain high quality hot gelatin products with low nitrogen content under industrial scale, the microorganism must be isolated and removed. In the invention, the solid substance of the first gel filtration of the hot gel fermentation liquor is processed, dissolved in an alkaline solution, and then the homogenized method is used to completely dissolve the insoluble colloid. The neutral red and aniline blue are used for dyeing and microscopic observation and examination, so as to ensure that the alkali solution does not contain insoluble colloid, and can significantly increase the subsequent pressure filtration rate and sterilization rate. It is beneficial to improve the quality of the final product of the thermal gel under the industrial scale.

【技术实现步骤摘要】
一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法
本专利技术涉及一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
热凝胶(Curdlan)又称凝胶多糖、可德兰胶、可得然胶等，是一种由微生物产生的胞外多糖，是以β-1,3-糖苷键连接而成的直链大分子，分子式为(C6H10O5)n。由于热凝胶独特的胶凝性质及其安全性，热凝胶在食品、工业、农业、药物等领域均具有大量的应用。热凝胶应用在食品方面可以作为增稠剂、稳定剂和胶凝剂等，同时还可以改善食品的口感和品质。热凝胶一般通过土壤杆菌或产碱杆菌通风发酵获得，以葡萄糖、蔗糖和糖蜜等为发酵碳源。热凝胶合成是典型的非耦联发酵过程，当培养基中的氮源耗尽时，微生物才开始合成热凝胶，发酵过程中控制合适的pH、碳源、氮源浓度有利于获得高浓度的热凝胶，因此已开发了补料发酵生产工艺，制备得到的热凝胶浓度为30-70g·L-1，而其中的菌体浓度为7-25g·L-1，除此之外外，热熔胶发酵液中还有一些残糖、有机酸、色素和无机盐等复杂成分。在大规模的热凝胶提取过程中，目前国内生产企业的提取工艺较为低效，其工艺流程如图1所示。热凝胶发酵液经压滤I处理后，得到的固形物中含有热凝胶、菌体和发酵液残留成分，加入净水后进行搅拌分散，进行压滤III，以去除部分游离的微生物菌体、无机盐和小分子物质，所得的滤饼中主要含有热凝胶和菌体，再加入乙醇后进行压滤IV，以进一步脱除色素、小分子物质和水分，减少固形物体积，最后得到的滤饼进行切割成小颗粒，进入到真空干燥机中干燥，最终得到热凝胶产品。由于整个流程中未进行专门的除菌操作，所得到的热凝胶品中仍含有大量的菌体，而残存的菌体是影响热凝胶产品品质的重要指标之一。在当前的热凝胶工业提取过程中，仅分离去除部分微生物菌体，能符合热凝胶产品的中国国家标准，但热凝胶品质与国际优质产品仍有不少差距，很难获得高品质的热凝胶产品，如何在工业规模下将微生物菌体从热凝胶发酵液中高效去除，是分离和纯化获得高品质热凝胶的关键技术。目前国内现有的热凝胶工业提取工艺过程中，没有独立的去除菌体单元，因此国内热凝胶产品(GB28304-2012)中的含氮量(≤1.5％)远高于联合国粮农组织和世界卫生组织下的JECFA标准(CurdlanINSNo.424)的含氮量(≤0.3％)。发酵过程中培养基的氮源耗尽时才能开始合成热凝胶，因此热凝胶发酵液中的含氮物质只有菌体物质，产品中的含氮物质是由残留的菌体细胞所组成的。由于热凝胶不溶于水，因此需要先将热凝胶溶于碱液或溶剂中，再实施固-液分离过程。在实验室规模下，热凝胶常见的提取方式为碱溶-离心法，可以在实验室规模下提取得到较纯的热凝胶，但由于热凝胶的碱溶胶具有很高黏度，同等的离心效果远非工业离心设备所能达到的，因此很难在工业规模下实现高效地分离去除微生物菌体。在工业规模下，从热凝胶发酵液中去除菌体细胞之所以难以有所突破，是因为其中存在着几个关键性的问题：(1)热凝胶不溶于水，直接去除菌体细胞属于固-固分离，为此我们需要利用热凝胶溶于碱的性质，将分离转化为固-液分离；(2)热凝胶的碱溶胶黏度高，流动性差，所以碱溶胶的流变学规律直接影响响着固-液分离的难易程度；(3)在压滤时，滤布容易被凝胶性物质堵塞，压滤速度下降严重，因此需要对影响压滤的因素进行分析和技术突破。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是去除热凝胶发酵液中的菌体细胞。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：对热凝胶发酵液进行压滤处理，在压滤后得到的固形物中加入碱性化合物溶液，充分搅拌混合后，再进行均质处理得到热凝胶碱溶胶，待确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物后，再进行第二次压滤处理，去除发酵液中的微生物菌体，以获得含氮量小于0.3％的热凝胶碱溶胶滤出液。在本专利技术的一种实施方式中，所述确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物的方法为显微镜镜检。在本专利技术的一种实施方式中，所述显微镜镜检方法为：取一滴热凝胶碱溶胶样品，经染色剂染色后再利用光学显微镜观察是否有不溶性胶质物存在，所述染色剂染色为中性红和苯胺蓝的混合染色剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述显微镜镜检的放大倍数为40～400倍。在本专利技术的一种实施方式中，所述碱性化合物溶液为NaOH溶液、KOH溶液、Na3PO4溶液、K3PO4溶液或Na2CO3溶液中的任一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述碱性化合物溶液的终浓度为0.2-0.8mol·L-1。在本专利技术的一种实施方式中，所述热凝胶碱溶胶中热凝胶的含量为1.0wt％-5.0wt％。在本专利技术的一种实施方式中，所述的均质处理为中、高压均质机处理或高速破碎剪切机处理中的任一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述中、高压均质机处理的均质压力为10-50MPa，连续处理，处理流速取决于均质机设备的规格和处理能力；所述高速破碎剪切机处理的转速为3000-5000r·min-1，处理时间为1-5h。在本专利技术的一种实施方式中，所述压滤处理所用的设备为厢式板框压滤机或隔膜式板框压滤机。在本专利技术的一种实施方式中，所述第二次压滤处理中的过滤压力为0.8-2.5MPa，过滤前在热凝胶碱溶胶中添加过滤前在热凝胶碱溶胶中添加2-20g·L-1助滤剂，所述助滤剂为珍珠岩、硅藻土、凹凸棒土中的任一种或几种。在本专利技术的一种实施方式中，在第二次压滤处理步骤前，在碱性化合物水溶液中添加2-20g·L-1助滤剂，配制成不含热凝胶的悬浊液，预涂压滤机的滤布，以利于后续压滤的有效进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法获得无菌体或菌体量显著减少的热凝胶碱溶胶滤出液后，还包括中和、水洗涤、乙醇洗涤脱水脱盐、切粒、真空干燥、粉碎和包装，即可获得热凝胶产品。本专利技术取得的有益效果：(1)本专利技术方法利用均质搅拌使得热凝胶碱溶胶中的不溶性胶质物的完全溶解，使得第二次压滤处理(压滤II)的过滤速度可达到20-60L·m-2·min-1，比未经均质处理的过滤速度提升了10-15倍，处理效率得到了极大的提升；(2)本专利技术在压滤前设置了凝胶颗粒的镜检步骤，是为了确保不溶性胶质物的完全去除，在本专利技术中，通过采用中性红和苯胺蓝的混合物对热凝胶碱溶胶进行染色，使得不溶性胶质物能够在显微镜下被发现，从而有助于确认其是否能够全部去除，这是本专利技术中压滤法去除菌体细胞的前提和关键步骤之一，而常规的压滤工艺，由于没有镜检这一步骤，不易察觉严重影响压滤速率的关键因素，因此常规的压滤工艺过滤速度较低，严重的降低了生产效率；(3)本专利技术方法在进行压滤之前，需要对压滤机进行NaOH溶液对压滤机进行循环清洗，同时使得压滤机和滤布处于碱性环境，使得其后续的压滤更容易进行；(4)利用本专利技术方法进行去除热凝胶发酵液中菌体细胞，菌体细胞的去除率高达80％，得到热凝胶的含氮量小于0.3wt％，能够获得高品质的热凝胶产品，能够实现高品质的热凝胶产品的工业化生产。附图说明图1：现有工业生产技术中的热凝胶提取工艺。图2：本专利技术的热凝胶去除菌体细胞工艺。图3：本专利技术中压滤II中去除菌体细胞工艺的实验结果。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。生物量(菌体量)、热凝胶含量及不溶物的测定：干重法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述方法为：对热凝胶发酵液进行压滤处理，在压滤后得到的固形物中加入碱性化合物溶液，充分搅拌混合后，再进行均质处理得到热凝胶碱溶胶，待确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物后，再进行第二次压滤处理，去除发酵液中的微生物菌体，以获得含氮量小于0.3％的热凝胶碱溶胶滤出液。

【技术特征摘要】
1.一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述方法为：对热凝胶发酵液进行压滤处理，在压滤后得到的固形物中加入碱性化合物溶液，充分搅拌混合后，再进行均质处理得到热凝胶碱溶胶，待确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物后，再进行第二次压滤处理，去除发酵液中的微生物菌体，以获得含氮量小于0.3％的热凝胶碱溶胶滤出液。2.根据权利要求1所述的一种热凝胶发酵液的去除菌体细胞方法，其特征在于，所述确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物的方法为显微镜镜检。3.根据权利要求2所述的一种热凝胶发酵液的去除菌体细胞方法，其特征在于，所述显微镜镜检为：将热凝胶碱溶胶经染色剂染色后再利用光学显微镜观察是否有不溶性胶质物存在，所述染色剂染色为采用中性红和苯胺蓝的混合染色剂对热凝胶碱溶胶进行染色。4.根据权利要求1-3任一所述的一种热凝胶发酵液的去除菌体细胞方法，其特征在于，所述碱性化合物溶液为NaOH溶液、KOH溶液、Na3PO4溶液、K3PO4溶液或Na2CO3溶液中的任一种，所述碱性化合物溶液的终浓度为0.2-0.8mol·L-1。5.根据权利要求1-4任一所述的一种热凝胶发酵液的去除菌体细胞方...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹晓北，郑志永，叶剑，朱莉，步国建，
申请(专利权)人：江南大学，泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32