一种芍药染色体的全年制片方法技术

本发明专利技术涉及一种芍药染色体的全年制片方法，包括如下步骤：(1)预处理：将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在3～5℃的条件下预处理9‑11h；(2)固定：将预处理后的材料转移至卡诺固定液中，在3～5℃条件下固定24h以上；(3)酸解：将固定后的材料转移至0.95‑1.05mol/L的盐酸溶液中，在温55～65℃下解离9‑11min；(4)染色压片。本发明专利技术提出了适用于芍药染色体全年制片的更为简单安全的方法，这种方法通过对各步骤参数的具体调整，可适用于芍药的大部分制片材料，实现全年范围内均可对芍药染色体进行制片，为对芍药的深入研究打下基础。

【技术实现步骤摘要】
一种芍药染色体的全年制片方法
本专利技术涉及植物的染色体制片方法，更具体地，涉及一种芍药染色体的全年制片方法。
技术介绍
芍药为芍药科芍药属多年生草本植物，芍药属分为三个组：牡丹组、芍药组和北美芍药组，本专利技术中芍药即指芍药组内的野生种或组内及组间的品种。芍药是我国传统名花，亦是我国传统的爱情之花，具有悠久的栽培历史和文化底蕴。栽培芍药品种花大、色艳且花型十分丰富，并具有庭院栽培、园林绿化、鲜切花、药用等多种应用形式，受到我国人民和世界其他国家的喜爱和关注。到目前为止，全世界在美国牡丹芍药协会(AmericanPeonySociety，APS)共登录有芍药品种逾5000多个，品种资源非常丰富。随着我国经济快速发展和人们生活水平的提高，近年来芍药鲜切花越来越受到我国人们的欢迎和追捧，在我国鲜切花市场所占比重正在大幅度的提升。植物染色体制片是进行核型分析、带型分析和染色体原位杂交等细胞遗传学研究的基础。近年来随着细胞遗传学研究在植物分类和育种中的应用，染色体制片技术尤为重要。芍药染色体属于大型染色体，长度约10-20μm，染色体基数为5。在芍药属的三个组里，仅芍药组内出现了二倍体和四倍体的倍性分化(其他两个组均为二倍体)。因此，在芍药栽培品种中，出现了二、三、四倍体的分化，但很多育种家并未重视这一现象，严重影响了育种效率。通过染色体制片技术可以研究芍药品种的倍性，制定合适的杂交计划，提高杂交育种的效率，同时也可以作为杂种鉴定的一种方法，培育更多的属于我国自主知识产权的芍药新品种。过去在芍药染色体制片的预处理上主要采用的化学试剂是秋水仙素、8-羟基喹啉和放线菌酮等，这些试剂基本都具有毒性，价格较贵或不易获得。细胞解离中使用酶解的方法，纤维素酶和果胶酶价格过于昂贵，且实验步骤较复杂。传统取材时间是在每年3-4月和10-11月，取材的时间较短。染色体显带、荧光原位杂交等技术需要大量的重复实验材料，虽然传统取材可获得分散均匀、清晰的染色体图像，但是无法对材料进行长久的保存，不利于芍药染色体的深入研究。
技术实现思路
本专利技术涉及一种芍药染色体的全年制片方法，包括如下步骤：(1)预处理：将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在3～5℃的条件下预处理9-11h；(2)固定：将预处理后的材料转移至卡诺固定液中，在3～5℃条件下固定24h以上；(3)酸解：将固定后的材料转移至0.95-1.05mol/L的盐酸溶液中，在温度55～65℃下解离9-11min；(4)染色压片：将解离后的材料进行常规压片法制片。本专利技术提出了适用于芍药染色体全年制片的更为简单安全的方法，这种方法通过对各步骤参数的具体调整，可适用于芍药的大部分制片材料。优选的，本专利技术中使用的用于制片的材料为：A、3月-4月，芍药植株早春萌动的新根的根尖，或者芍药未出土的芽；B、4月-6月，芍药出土后的茎尖，或者芍药的幼嫩心皮；C、6月-9月，芍药茎插所产生不定根的根尖；D、9月-11月，芍药植株秋季萌发的新根的根尖；E、11月-次年2月，芍药根插后所得不定根的根尖。在本专利技术的方法下，本专利技术提出了在全年周期内可进行制片的材料，这大大延长了芍药可进行制片的时间长度，有利于芍药染色体的深入研究。优选的，所述的芍药植株早春萌动新根的根尖，为早春芍药肉质根自然萌动长出的幼嫩根系的根尖1-2cm处；优选的，所述的芍药未出土的芽尖为芍药早春萌动后的混合芽剥去外围较大的鳞片后所得的芽尖。优选的，所述的芍药出土后的茎尖，为芍药植株萌发出土且未显蕾时剥去外围鳞片所得的顶端的茎尖；优选的，所述的芍药的幼嫩心皮为芍药植株显蕾至柱头授粉前的10天内，剥去花蕾的花瓣后留下的幼嫩心皮。优选的，所述的芍药茎插所产生不定根的根尖为以芍药茎秆为插穗扦插后所生不定根的根尖1-2cm处。优选的，所述的芍药植株秋季萌发新根的根尖为芍药肉质根上幼嫩新根的根尖1-2cm处。优选的，所述的芍药根插后所得不定根的根尖，为芍药肉质根扦插所得到的不定根的根尖1-2cm处。优选的，所述染色制片的过程中以卡宝品红为染色剂，染色5～6min。优选的，所述步骤1)中将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在4℃的条件下预处理10h。优选的，将固定后的材料转移至1mol/L的盐酸溶液中，在温60℃下解离10min。本专利技术中的制片采用常规的制片方法均可实现，主要包括如下步骤：用解剖针取解离后的材料，并用解剖针捣碎，加卡宝品红溶液1-2滴，再将其搅拌均匀，染色5min后，盖上盖玻片，用滤纸夹住玻片，再用解剖针的另一头轻轻的砸盖玻片，使细胞和染色体分布均匀。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术的染色制片方法适用范围，针对芍药全年范围内分生能力强的组织，均可实现成功的制片。2)该方法根据时间直接选取芍药不同分生组织或者间接通过对芍药不同器官进行处理后所获得的分生组织作为染色体制片材料，可获得较多分裂相、分散良好、清晰的染色体图像，适用于后期的核型分析。总之本专利技术不仅克服了芍药染色体研究中染色体制片取材周期较短、时间受限的问题，而且制片技术成本低廉，简单方便。附图说明图1：早春萌动芍药植株根系(箭头所指为新生根尖)。图2：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间10min，染色时间5min)。图3：芍药未出土的混合芽(箭头所指为当年生新芽)。图4：芍药未出土的芽尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。图5：芍药出土后未展叶植株。图6：芍药出土后的茎尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。图7：芍药的幼嫩心皮。图8：芍药的幼嫩心皮染色体63倍光学显微镜镜检图像。图9：芍药茎插后产生不定根(箭头所指为不定根)。图10：芍药茎插所产生不定根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。图11：秋季萌发新根的芍药植株。图12：芍药植株秋季萌发新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。图13：芍药根插后产生不定根。图14：芍药根插后所得不定根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。图15：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间6h，解离时间5min，染色时间3min)。图16：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间8h，解离时间10min，染色时间5min)。图17：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间5min，染色时间5min)。图18：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间10min，染色时间3min)。图19：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(1mol/L冰醋酸解离时间10min)。图20：芍药植株春季嫩茎的染色体63倍光学显微镜镜检图像。图21：芍药植株夏季未出土地下芽的染色体63倍光学显微镜镜检图像。图22：芍药植株初冬时期的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例仅用于进一步说明本专利技术的内容，不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，本专利技术实施例中所用的技术手段为本领本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芍药染色体的全年制片方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)预处理：将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在3～5℃的条件下预处理9‑11h；(2)固定：将预处理后的材料转移至卡诺固定液中，在3～5℃条件下固定24h以上；(3)酸解：将固定后的材料转移至0.95‑1.05mol/L的盐酸溶液中，在温度55～65℃下解离9‑11min；(4)染色压片。

【技术特征摘要】
1.一种芍药染色体的全年制片方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)预处理：将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在3～5℃的条件下预处理9-11h；(2)固定：将预处理后的材料转移至卡诺固定液中，在3～5℃条件下固定24h以上；(3)酸解：将固定后的材料转移至0.95-1.05mol/L的盐酸溶液中，在温度55～65℃下解离9-11min；(4)染色压片。2.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，所述用于制片的材料为：A、3月-4月，芍药植株早春萌动的新根的根尖，或者芍药未出土的芽；B、4月-6月，芍药出土后的茎尖，或者芍药的幼嫩心皮；C、6月-9月，芍药茎插所产生不定根的根尖；D、9月-11月，芍药植株秋季萌发的新根的根尖；E、11月-次年2月，芍药根插后所得不定根的根尖。3.根据权利要求2所述的制片方法，其特征在于，所述的芍药植株早春萌动新根的根尖，为早春芍药肉质根自然萌动长出的幼嫩根系的根尖1-2cm处；和/或，所述的芍药未出土的芽尖为芍药早春萌动后的混合芽剥去外围较大的鳞片后所得的芽尖。4.根据权利要求2所述的制片方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓南，朱炜，郑严仪，赵芮，程堂仁，张启翔，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11