一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用，所述处理方法包括如下步骤：将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；将组织膨胀处理剂充分浸泡过的组织放入组织收缩剂中，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；将在组织收缩剂中充分处理的组织放入折射率匹配试剂进行浸泡，最终得到折射率相对均一的高度透明化的组织。经本发明专利技术处理后的组织变得高度透明，可以用于组织整体三维荧光成像中，实现对全脑神经网和器官血管网结构进行三维高分辨成像。

【技术实现步骤摘要】
一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用
本专利技术属于生物医学光学成像
，尤其涉及一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用。
技术介绍
生物组织的整体高分辨成像可以为生命科学的研究提供完整、精细的三维组织结构信息，从而更好地理解组织网络结构与功能的关系。基于传统组织切片技术获取三维结构，费时费力，且易导致结构信息的丢失，图像重建难度大。近年来，多种荧光标记技术及显微成像技术的结合为获取组织的三维结构信息提供了全新思路。然而，生物组织的高散射特性使得光学成像技术在生物组织中的成像深度有限，无法满足大块组织的成像需求，如激光共聚焦显微镜的深度约为50-100μm,双光子显微镜的成像深度也仅有500-800μm,组织光透明技术的出现为大组织三维结构的整体成像提供了重要方法。组织光透明技术即通过向组织中引入高渗、高折射率的化学试剂，提高组织中各成分间折射率匹配程度，降低组织的散射，使组织变得“透明”,从而提升光学显微镜的成像深度。近年来，组织光透明的发展吸引了众多神经科学家的关注与参与，不断有新的光透明方法被提出。其中基于水溶性试剂的方法以其对荧光信号的较好保持和对样本形变的有效控制，受到生命学家的青睐。然而，基于水溶性试剂的方法透明速度缓慢，往往需要数周甚至数月的时间来实施组织透明，并且透明效果有限。这种缺点极大的限制了目前光透明方法在生命科学研究中的应用。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的方法及其应用，经处理后的多种组织可在短时间内变得高度透明，可以用于组织整体荧光显微成像中，实现对全脑神经网和器官血管网结构的三维高分辨荧光成像。为了达到上述目的，本专利技术第一方面提供了一种基于水溶性试剂的快速组织透明化方法，所述处理方法包括如下步骤：S1、将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；S2、将步骤S1所得组织放入组织收缩剂中处理，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；S3、将步骤S2所得组织放入折射率匹配剂中浸泡，得到折射率相对均一的高度透明化的组织。优选的，步骤S1中，所述组织膨胀处理剂的组份包括间苯二甲胺和山梨醇，其余为水。间苯二甲胺携带的双NH3基团会与组织发生水合作用，解离组织中致密的纤维，溶解脂质，使组织迅速吸水膨胀，从而降低组织各成分折射率的差异，加快处理速度。山梨醇则为良好的组织结构保持剂，避免组织结构和一些蛋白遭到破坏。作为进一步的优选，步骤S1中，所述组织膨胀处理剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为5％-20％、5％-15％。优选的，步骤S2中，所述组织收缩剂的组份包括间苯二甲胺、山梨醇和磷酸盐缓冲液。作为进一步的优选，步骤S2中，所述组织收缩剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为20％-40％、15％-30％，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M-0.05M。提升间苯二甲胺、山梨醇的浓度可以对经膨胀后的组织实施快速透明化，并控制膨胀的组织进行回缩，同时磷酸盐缓冲液的引入进一步增加溶液的渗透压，使组织向最初形态收缩。优选的，步骤S3中，所述折射率匹配剂的组份包括间苯二甲胺和山梨醇，其余为水。作为进一步的优选，步骤S3中，所述折射率匹配剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为40％-60％、35％-50％。最大化的提升间苯二甲胺及山梨醇的浓度，获得折射率高于1.50的水溶液，使得组织最终达到折射率相对均一的程度，完成组织透明化处理。优选的，所述组织包括小鼠1-2mm厚的脑切片、小鼠全脑、小鼠心脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、胃、肠，或小鼠胚胎。作为进一步的优选，步骤S1中，所述浸泡的时间根据组织类型分别为：1-2mm厚的脑切片0.5h-6h，小鼠全脑24-36h，小鼠心脏12-24h、肝脏24-36h、肾脏12-24h、肺脏12-24h、脾脏12-24h、胃6-12h、肠3-6h，小鼠胚胎4-8h；步骤S2中，所述处理的时间根据组织类型分别为：1-2mm厚的脑切片0.5h-3h，小鼠全脑8-12h，小鼠心脏4-8h、肝脏8-12h、肾脏8-12h、肺脏8-12h、脾脏4-8h、胃4-8h、肠1-2h，小鼠胚胎1-2h；步骤S3中，所述浸泡的时间根据组织类型分别为：1-2mm厚的脑切片0.5h-3h，小鼠全脑8-12h，小鼠心脏4-8h、肝脏8-12h、肾脏8-12h、肺脏8-12h、脾脏4-8h、胃4-8h、肠1-2h，小鼠胚胎1-2h。优选的，步骤S1中，所述固定是采用4％多聚甲醛对组织进行固定。本专利技术第二方面提供了一种基于水溶性试剂的快速组织透明化方法的应用，将上述处理方法处理过的组织用于共聚焦、双光子或光片荧光显微成像。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术处理方法先将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中浸泡去脂，得到疏松膨胀的组织；然后将膨胀组织放入组织收缩剂中，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；再将初步透明的组织放入折射率匹配剂进行浸泡，最终得到折射率相对均一的高度透明化的组织。(2)本专利技术处理方法中选用组织膨胀处理剂、组织收缩剂及折射率匹配剂，是通过向组织中引入强水合作用的化学试剂，从而快速地疏松组织内致密纤维，去除高折射率的脂质，继而引入高折射率试剂迅速使得组织内部折射率均一化，降低组织内部散射，使其变得高度透明，大大提高成像深度，并且通过控制试剂浓度可以保证透明后的样本无显著形变。综上所述，本专利技术处理方法具有如下优点：(i)简单稳定；(ii)足够透明，使用光片照明荧光显微镜可以实现对全脑神经网以及血管网结构进行三维高分辨成像；(iii)透明时间短、透明速度快；(iiii)无显著形变。附图说明图1为本专利技术实施成年小鼠组织透明化处理方法的流程示意图。图2a-2b为离体小鼠2mm脑片经光透明处理前后所拍摄的直观图像。图2c为统计的脑切片经透明前后的透过率曲线。图3a-3b为所拍摄的皮层锥体神经元在光透明处理前后荧光信号对比图，图3a为光透明处理前，图3b为光透明处理后。图3c为所拍摄的脑中小胶质细胞在光透明处理前后的荧光成像深度图。图4a-4b给出了离体小鼠各器官经光透明处理前后所拍摄的直观图像。图5给出了经本专利技术透明后的小鼠全脑经光片照明成像获取的全脑三维神经分布图像。图6给出了经本专利技术透明后的小鼠肝脏经光片照明成像获取的整体三维血管分布图像。具体实施方式本专利技术主要提供了一种基于水溶性试剂的快速组织透明化方法及其应用，成功克服了国外现有光透明方法透明速率慢、透明效果差、荧光兼容性差的缺陷。为了解决上述缺陷，本专利技术实施例的主要思路是：本专利技术实施例基于水溶性试剂的快速组织透明化方法，所述处理方法包括如下步骤：将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；将组织膨胀处理剂充分浸泡过的组织放入组织收缩剂中，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；将在组织收缩剂中充分处理的组织放入折射率匹配剂进行浸泡，最终得到折射率相对均一的高度透明化的组织；将所述处理方法处理过的组织用于共聚焦及光片荧光显微成像中；可大大提升荧光成像深度，实现对小鼠全脑神经网和器官血管网结构的三维高分辨成像。本专利技术实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法，其特征在于：所述处理方法包括如下步骤：S1、将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；S2、将步骤S1所得组织放入组织收缩剂中处理，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；S3、将步骤S2所得组织放入折射率匹配剂中浸泡，得到折射率相对均一的高度透明化的组织。

【技术特征摘要】
1.一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法，其特征在于：所述处理方法包括如下步骤：S1、将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；S2、将步骤S1所得组织放入组织收缩剂中处理，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；S3、将步骤S2所得组织放入折射率匹配剂中浸泡，得到折射率相对均一的高度透明化的组织。2.根据权利要求1所述的基于水溶性试剂的快速组织透明化处理方法，其特征在于：步骤S1中，所述组织膨胀处理剂的组份包括间苯二甲胺和山梨醇，其余为水。3.根据权利要求2所述的基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法，其特征在于：步骤S1中，所述组织膨胀处理剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为5％-20％、5％-15％。4.根据权利要求1所述的基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法，其特征在于：步骤S2中，所述组织收缩剂的组份包括间苯二甲胺、山梨醇和磷酸盐缓冲液。5.根据权利要求4所述的基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法，其特征在于：步骤S2中，所述组织收缩剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为20％-40％、15％-30％，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M-0.05M。6.根据权利要求1所述的基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法，其特征在于：步骤S3中，所述折射率匹配剂的组份包括间苯二甲胺和山梨醇，其余为水。7.根据权利要求6所述的基于水溶性试剂的快速组织透明...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱，朱京谭，俞婷婷，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42