一种李小食心虫的PCR检测引物及检测方法技术

本发明专利技术涉及李小食心虫的检测技术领域，具体公开一种李小食心虫的PCR检测引物。所述检测引物的序列为：上游引物Gf‑346‑F：5’－CCTCTCCTCCAATATTGCCCA－3’；下游引物Gf‑528‑R：5’－TGAAAGTAGAAGTAATAAGG－3’。本发明专利技术设计的李小食心虫的PCR检测引物能够从众多亲缘近似种和生态近似种中快速检测出李小食心虫，该引物特异性高，扩增效果好，降低了检测难度及检测成本，大大提高了果园防治虫害的针对性和防治效率。

【技术实现步骤摘要】
一种李小食心虫的PCR检测引物及检测方法
本专利技术涉及李小食心虫的检测
，尤其涉及一种李小食心虫的PCR检测引物及检测方法。
技术介绍
李小食心虫，为鳞翅目卷蛾科小食心虫属的一种昆虫，分布于东北、华北、西北等各地，寄主有李、杏、樱桃、桃、郁李等多种植物，其中以李受害最重，幼虫蛀果前常在果面上吐丝结网，栖于网下开始啃食果皮蛀入果内，早期入果孔为黑色，数日后即有虫粪排出，造成豆粒大的果实大量脱落，之后被害果在入果孔流出大量水珠状果胶滴，李小食心虫入果后会蛀食果仁或纵横串食，并串到果柄附近咬坏输导系统，使果实变紫红色，不易再食用，对果园造成严重的损失。李小食心虫还有很多亲缘近似种和生态近似种，包括梨小食心虫、苹小食心虫、麻小食心虫、苹果蠹蛾、白小食心虫、桃蛀螟、梨大食心虫、桃小食心虫，全部为鳞翅目昆虫，除麻小食心虫为取食大麻和律草的种类外，其它种类均为中国北方蔷薇科果树(苹果、梨、桃、杏、李、山楂等)的常见蛀果害虫，且食心虫幼虫的外部形态十分相似，增加传统形态鉴定难度，若对食心虫的种类判断不正确，对其生长规律不了解，则很容易采用错误的防治方法，很多环境友好的防治方法都有很强的专一性，这些方法只对一种害虫防治有效，因此使用时必须准确的鉴定出害虫的种类。目前对小食心虫属的鉴定，主要依靠传统的形态学方法以及基于COI的DNA条形码技术。然而形态学方法需要鉴定人员具有鳞翅目分类鉴定的研究背景或丰富的鉴定经验，且掌握较全面的鉴定资料，如鉴定幼虫标本还需掌握幼虫的鉴定特征及资料，这对于一般检测人员都难以做到，而且鳞翅目标本的易损性更加大了形态学方法鉴定的难度。DNA条形码技术确实是一种简单有效的方法，但该方法不仅需要对提取的核酸进行条形码片段的扩增，还需进行测序和比对，而测序工作一般需要测序公司完成，大大延长了检测周期，后续的比对工作也需要获得全面而准确的数据库。
技术实现思路
针对现有李小食心虫检测难度大、方法复杂、检测周期长、检测成本高等问题，本专利技术提供一种李小食心虫的PCR检测引物。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种李小食心虫的PCR检测引物，检测引物的序列为：上游引物Gf-346-F：5’－CCTCTCCTCCAATATTGCCCA－3’；下游引物Gf-528-R：5’－TGAAAGTAGAAGTAATAAGG－3’。相对于现有技术，本专利技术提供的李小食心虫的PCR检测引物特异性高，用该检测引物对李小食心虫以及李小食心虫的8种亲缘近似种和生态近似种(梨小食心虫、苹小食心虫、麻小食心虫、苹果蠹蛾、白小食心虫、桃蛀螟、梨大食心虫和桃小食心虫)的基因组DNA进行PCR扩增检测，该PCR检测引物只能以李小食心虫的基因组DNA为模板得到扩增产物，其他亲缘近似种和生态近似种都无法得到扩增产物，即通过扩增产物的凝胶电泳结果就可判断出是否为李小食心虫，因此通过本专利技术设计的李小食心虫的PCR检测引物能够快速准确的从所有亲缘近似种和生态近似种中检测出李小食心虫，检测方法简单快捷、成本低。进一步地，本专利技术还提供了利用所述引物进行李小食心虫PCR检测的方法，该使用方法，包括以下步骤：a、提取待检测昆虫的基因组DNA；b、以步骤a中的基因组DNA为模板，用检测引物进行PCR检测；c、对步骤b中的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测。优选地，所述步骤a中采用幼虫腹部组织进行DNA提取。优选地，所述基因组DNA的提取采用CTAB法提取或基因组提取试剂盒提取。优选地，提取的基因组DNA用COI通用引物进行PCR检测，根据扩增产物判断提取的基因组DNA的准确性。优选地，所述COI通用引物为：COI-F：5’-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3’；COI-R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。优选地，所述步骤b中PCR检测的扩增体系为25μl，包括：12.5μl的2×PremixExTaq、1μl的Gf-346-F、1μl的Gf-528-R、1μl的DNA模板和9.5μl的去离子水。优选地，所述Gf-346-F和Gf-528-R的浓度为10μM。优选地，所述PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退30s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸10min。附图说明图1是本专利技术实施例2中用PCR检测引物对9种昆虫的基因组DNA的扩增产物进行的琼脂糖凝胶电泳图；其中，最左侧的DNAMarker条带从下向上大小依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1李小食心虫的PCR检测引物的设计：将李小食心虫的COI序列(SEQIDNO:1)与NCBI数据库中能下载到的Grapholita属中所有的种的COI序列进行对比，根据李小食心虫的COI序列相对于对比序列的差异性位点设计得到李小食心虫的PCR检测引物，设计得到的引物由上海生物工程股份有限公司合成，PCR检测引物的具体序列如下：Gf-346-F：5’－CCTCTCCTCCAATATTGCCCA－3’；Gf-528-R：5’－TGAAAGTAGAAGTAATAAGG－3’。实施例2利用实施例1设计的引物对李小食心虫及其8种亲缘近似种和生态近似种(李小食心虫、梨小食心虫、苹小食心虫、麻小食心虫、苹果蠹蛾、白小食心虫、桃蛀螟、梨大食心虫和桃小食心虫)进行检测，检测方法如下：a、提取待检测昆虫的基因组DNA：分别取李小食心虫、梨小食心虫、苹小食心虫、麻小食心虫、苹果蠹蛾、白小食心虫、桃蛀螟、梨大食心虫、桃小食心虫的幼虫腹部组织进行DNA的提取，将腹部组织分别置于1.5ml离心管中，加液氮充分研磨，采用天根生化科技(北京)公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明书方法提取基因组DNA，提取的基因组DNA用NanoDrop2000C分光光度计进行DNA浓度的检测，并将提取的DNA样品于-20℃冰箱保存备用，DNA浓度的检测结果如表1所示。表1将提取到的9种基因组DNA稀释或者浓缩为50ng/μl，使用上海生物工程股份有限公司合成的COI通用引物对提取的9种基因组DNA样品进行扩增验证，PCR仪使用Whatman公司生产的型号为BIO-RADT100ThermalCycler的梯度PCR仪，根据扩增产物大小及测序结果来验证基因组DNA样品的准确性。其中COI通用引物为：COI-F：5’-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3’；COI-R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。对提取的基因组DNA样品进行PCR扩增验证的体系为50μl，包括：扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸10min。对得到的9种扩增产物进行测序，测序结果如SEQIDNO:1-SEQIDNO:9所示，根据测序结果比对，只有苹小食心虫测序结果为数据库中没有的COI序列的种类，但苹小食心虫的COI序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种李小食心虫的PCR检测引物，其特征在于：所述检测引物的序列为：上游引物Gf‑346‑F：5’－CCTCTCCTCCAATATTGCCCA－3’；下游引物Gf‑528‑R：5’－TGAAAGTAGAAGTAATAAGG－3’。

【技术特征摘要】
1.一种李小食心虫的PCR检测引物，其特征在于：所述检测引物的序列为：上游引物Gf-346-F：5’－CCTCTCCTCCAATATTGCCCA－3’；下游引物Gf-528-R：5’－TGAAAGTAGAAGTAATAAGG－3’。2.利用权利要求1所述引物对李小食心虫进行PCR检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、提取待检测昆虫的基因组DNA；b、以步骤a中的基因组DNA为模板，用检测引物进行PCR检测；c、对步骤b中的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测。3.如权利要求2所述的对李小食心虫进行PCR检测的方法，其特征在于：所述步骤a中采用幼虫腹部组织进行DNA提取。4.如权利要求2-3任一项所述的对李小食心虫进行PCR检测的方法，其特征在于：所述基因组DNA的提取采用CTAB法提取或基因组提取试剂盒提取。5.如权利要求4所述的对李小食心虫进行PCR检测的方法，其特征在于：提取的基因组DNA用COI通用引物进行PCR检测，根据扩增产物判断...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄巧哲，刘立兵，张丽杰，蔡波，李海云，项佳林，陈志敏，
申请(专利权)人：河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：河北,13