一种放流中国对虾资源的调查方法技术

本发明专利技术提供一种可对放流中国对虾的时空分布与种群动态变化实现快速且精确的调查方法，用于放流个体的检测方法是通过特异性扩增水体环境中中国对虾释放的DNA来完成的，其主要来源于中国对虾的排泄物以及虾体的脱落物，对处于任何生长时期的中国对虾均能够起到有效的检测效果，且不需要采集任何中国对虾标本，通过实时荧光定量PCR不仅能够对中国对虾的有无进行判断，而且能够通过中国对虾释放的DNA的拷贝数推测出中国对虾的生物量，能够快速且准确地对中国对虾的时空分布与种群动态变化进行检测，进而对增殖放流的效果进行评估。

【技术实现步骤摘要】
一种放流中国对虾资源的调查方法
本专利技术属于海水动物放流
，具体地涉及一种放流中国对虾资源的调查方法，即一种全新的可对放流中国对虾的时空分布与资源动态变化实现精确调查的方法。
技术介绍
中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)是我国特有的一年生大型经济虾类，主要分布在黄渤海沿岸海区，经济效益显著。二十世纪八十年代以来，由于捕捞强度的不断加大、生态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野生中国对虾的盲目需求等综合因素的影响，中国对虾野生资源量急剧萎缩。为保护、恢复中国对虾种群和渔业资源，我国于1984年开始在特定海区进行中国对虾移殖/增殖放流，每年放流约30亿尾仔虾。经过连续多年的大规模种苗放流，中国对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法精确地掌握放流群体的时空分布与资源量动态变化，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平，分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是中国对虾放流迫切需要解决的重大问题。精确掌握物种的时空分布和种群动态变化是合理利用和开发渔业资源的前提。然而，对于研究人员与政策制定者而言，收集水生生物种群分布与种群动态变化的精确数据是其面临的最大挑战。传统的资源调查方法费时费力且灵敏度低下，往往不能真实地反映出中国对虾的时空分布与种群的资源量动态变化情况，这主要是由于中国对虾的生活史类型导致：1)在增殖放流前期，中国对虾本底资源量匮乏，运用传统的资源调查方法对其进行检测效率低且效果差；2)在增殖放流初期，中国对虾游泳能力薄弱，用传统的调查方法不能准确地获取有关其种群分布与资源量动态变化的信息；3)目前国内渔业资源调查主要以底拖网为主，而底拖网并非中国对虾渔业资源的调查方式。因此，探索一种能够准确检测中国对虾时空分布与资源量动态变化的方法至关重要。并且该方法应该具备以下特征：1)能够准确地检测到中国对虾而不受其他物种的干扰；2)检测的最终结果不受到人为主观因素的影响。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可对放流中国对虾的时空分布与种群动态变化实现快速且精确的调查方法，从而掌握中国对虾自放流后在自然海域中的分布与种群动态变化，以精确评估中国对虾放流效果，进而制定科学的放流规划、有效促进野生中国对虾种群资源的恢复。本专利技术的放流中国对虾资源的调查方法，包括以下的步骤1)自中国对虾放流后，在调查海域采集水样，并用0.45μm的玻璃纤维滤膜结合真空过滤装置过滤2L海水进行样品的富集，其中每个采样点做3次技术重复，收集的样品准备进行eDNA的提取；2)提取步骤1)收集样品的eDNA，并将eDNA稀释到定量PCR所要求的浓度范围以内；3)采用荧光定量检测系统进行样品eDNA的定量分析，荧光定量检测系统根据荧光值的变化生成中国对虾mtDNACOI基因的标准曲线与扩增曲线,从而自动得出未知浓度eDNA样品中中国对虾mtDNACOI基因的拷贝数；根据定量PCR的结果最终确定中国对虾在自然海域中的时空分布与资源量动态变化；其中所述的中国对虾eDNA检测技术中实时荧光定量PCR的引物以及探针的序列如下：正向序列COIDF为：AGGGGTAGGAACAGGATGAAC(SEQIDNO:1)、反向序列COIDR为：GACACCAGCTAGATGCAGCG(SEQIDNO:2)、探针Probe为：5＇FAM-TCAGCTAGAATTGCTCATGCCGGAGCTTCAGT-3＇BHQ1(SEQIDNO:3)；进一步，所述的实时荧光定量PCR的反应体系为：20μl反应体系，其中包括10μL2×TaqManFastqPCRMasterMix，0.4μLForward引物(10μmol·L–1)，0.4μLReverse引物(10μmol·L–1)，0.4μL探针(10μmol·L–1)，2μL模板DNA，6.8μLPCR-gradewater；进一步，所述的实时荧光定量PCR的扩增反应程序为2步法：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃退火延伸34s，40个循环。其中在定量分析时，所使用的中国对虾eDNA检测技术中制备标准品质粒DNA所用的普通PCR引物序列如下：正向序列COIPF为：TTGTAGTTACAGCCCACGCT(SEQIDNO:4)，反向序列COIPR为：AAATTATCCCGAAGGCGGGT(SEQIDNO:5)；进一步，所述的普通PCR的反应体系为：50μl反应体系，其中10×TaqBuffer5μL，dNTPs(各2.5mM)1μL，正反向引物(COIPF/COIPR)(10mM)各1μL，TaqDNAPolymerase(5U/μL)1μL，模板DNA(50ng/μL)2μL,MgCl2(25mM)3μL，ddH2O36μL；进一步，所述的第一组引物的PCR的扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复延伸10min；4℃保存并结束程序。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术能够实现对整个海域所有放流群体的精确检测，为增殖放流效果的评价奠定了基础。与现有技术相比的优势主要在以下几个方面：1)灵敏度高，该技术不受种群密度与生活史特征的影响，具有较高的检出率；2)经济高效，省时省力，该技术比传统方法需要更少的物力、财力、人力以及时间；3)对生态系统干扰低，技术只需要对采集的水样进行分析便可以得到结果，对生物及生态系统干扰较低；4)对调查人员的要求低，该技术只需要分子生物学的方法即可，而不要求调查人员具有很强的形态学分类鉴定能力；5)采样受限小，该技术所要求的采样方法简单且要求低，受外界影响因素更小。本专利技术用于放流个体的检测方法是通过特异性扩增水体环境中中国对虾释放的DNA来完成的，其主要来源于中国对虾的排泄物以及虾体的脱落物，对处于任何生长时期的中国对虾均能够起到有效的检测效果，且不需要采集任何中国对虾标本，通过实时荧光定量PCR不仅能够对中国对虾的有无进行判断，而且能够通过中国对虾释放的DNA的拷贝数推测出中国对虾的生物量，能够快速且准确地对中国对虾的时空分布与种群动态变化进行检测，进而对增殖放流的效果进行评估。附图说明图1：中国对虾eDNA降解与时间之间的关系图；图2：不同滤膜类型及过滤水量所富集的eDNA的浓度图；图3：不同滤膜类型及过滤水量所富集的eDNA的产量图；图4：2017年6月使用本专利技术方法对渤海中国对虾的调查图。具体实施方式为了解决
技术介绍
中所列出的需要具备的2个条件：1)能够准确地检测到中国对虾而不受对虾属其他亲缘物种的干扰；2)检测的最终结果不会受到人为主观因素的影响，不会由于人为因素而导致结果误判。eDNA(environmentalDNA,eDNA)是指从皮肤、粘液、唾液、精子、分泌物、卵、粪便、尿液、血液、根、叶、果实、花粉和腐烂体等释放出来的游离的DNA分子。本专利技术对采集样品的eDNA进行检测，通过建立的方法来有效的收集放流中国对虾的eDNA，通过设计的高度特异性的引物，利用实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)扩增来自海洋环境的eDNA，根据PCR反应的最终结果进行相关的定性与定量分析研究，从而推测出自然海域中国对虾的时空分布与种群的动态变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种放流中国对虾资源的调查方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤1)自中国对虾放流后，在调查海域采集水样，并用0.45μm的玻璃纤维滤膜结合真空过滤装置过滤2L海水进行样品的富集，收集的样品准备进行eDNA的提取；2)提取步骤1)收集样品的eDNA，并将eDNA稀释到定量PCR所要求的浓度范围以内；3)采用荧光定量检测系统进行样品eDNA的定量分析，荧光定量检测系统根据荧光值的变化生成中国对虾mtDNA COI基因的标准曲线与扩增曲线,从而自动得出未知浓度eDNA样品中中国对虾mtDNA COI基因的拷贝数；根据定量PCR的结果最终确定中国对虾在自然海域中的时空分布与资源量动态变化。

【技术特征摘要】
1.一种放流中国对虾资源的调查方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤1)自中国对虾放流后，在调查海域采集水样，并用0.45μm的玻璃纤维滤膜结合真空过滤装置过滤2L海水进行样品的富集，收集的样品准备进行eDNA的提取；2)提取步骤1)收集样品的eDNA，并将eDNA稀释到定量PCR所要求的浓度范围以内；3)采用荧光定量检测系统进行样品eDNA的定量分析，荧光定量检测系统根据荧光值的变化生成中国对虾mtDNACOI基因的标准曲线与扩增曲线,从而自动得出未知浓度eDNA样品中中国对虾mtDNACOI基因的拷贝数；根据定量PCR的结果最终确定中国对虾在自然海域中的时空分布与资源量动态变化。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)其中每个采样点做3次采样重复。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中实时荧光定量PCR的引物以及探针的序列如下：正向引物的序列为SEQIDNO:1,反向引物的序列为SEQIDNO:2；探针的序列为SEQIDNO:3。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的探针的5＇端用FAM标记，3＇端用BHQ1标记。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，所述的实时荧光定量PCR的反应体系为20μl反应体系，其中包括10μL2×TaqManFastqPCRMasterMix，0.4μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李苗，单秀娟，王伟继，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37