Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新靶标抗原及其鉴别方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标及其鉴别方法和应用。本发明专利技术提供的鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，靶标分子通过激光共聚焦显微镜方法鉴定肿瘤细胞表面的异位表达得到，针对靶标分子进行如下操作：检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子封闭肿瘤细胞、靶标分子缺陷型肿瘤细胞和靶标分子过表达型肿瘤细胞的杀伤作用。该方法可以快速准确的得到Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标，这为了解Vγ9δ2T细胞的杀伤机制和肺鳞状上皮细胞癌的过继免疫治疗提供了新的思路和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新靶标抗原及其鉴别方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标及其鉴别方法和应用。
技术介绍
肺癌是世界上致死率最高的癌症，其中非小细胞性肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80％。肺癌的高发病率、高致死率及有效治疗手段的缺乏燃起了众多研究者对新型肺癌免疫治疗策略的探索。其中，免疫关节点抑制剂及基于杀伤性T细胞的免疫过继治疗策略近年来引起了广泛关注。Vγ9δ2T细胞是人外周血γδT细胞的主要亚群(比例约为50-90％)，能以MHC非限制性方式识别表达在肿瘤细胞表面的应激性内源性蛋白质抗原，对多种血液肿瘤及实体肿瘤均有直接杀伤作用。然而，Vγ9δ2T细胞识别杀伤肺癌的分子机制目前尚不十分清楚，对于Vγ9δ2T细胞如何在肿瘤治疗中发挥更佳作用也缺乏更好的技术手段。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，以缓解现有技术中缺少一种可以有效鉴定发现新型靶标的方法。本专利技术的第二目的在于提供利用上述方法得到的新型靶标。本专利技术的第三目的在于提供上述新型靶标在制备肺鳞状上皮细胞癌免疫过继治疗药物中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，包括以下步骤：针对靶标分子进行如下a)-c)的操作：a)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子封闭的肿瘤细胞的杀伤作用；b)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子缺陷型的肿瘤细胞的杀伤作用；c)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子过表达的肿瘤细胞的杀伤作用；所述靶标分子通过激光共聚焦显微镜方法鉴定肿瘤细胞表面异位表达得到。进一步地，a)和b)中所述的杀伤作用显著降低，所述靶标分子为Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标。进一步地，c)中所述的杀伤作用显著提升，所述靶标分子为Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标。进一步地，所述检测采用CytoTox96非放射杀伤试剂盒。进一步地，所述靶标分子封闭的肿瘤细胞通过采用靶标分子抗体封闭肿瘤细胞上异位表达的靶标分子得到。进一步地，所述肿瘤细胞包括GLC-82、NCI-H446或NCI-H520中的至少一种，优选为NCI-H520。进一步地，所述靶标分子包括hMSH2。进一步地，hMSH2缺陷型肿瘤细胞的构建包括采用siRNA转入肿瘤细胞干扰hMSH2基因表达的步骤。上述方法得到的新型靶标。上述新型靶标在制备肺鳞状上皮细胞癌免疫过继治疗药物中的应用；优选地，所述新型靶标为hMSH2。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，靶标分子通过激光共聚焦显微镜术鉴定肿瘤细胞表面的异位表达得到，针对靶标分子进行如下a)-c)的操作：a)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子封闭的肿瘤细胞的杀伤作用；b)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子缺陷型的肿瘤细胞的杀伤作用；c)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子过表达的肿瘤细胞的杀伤作用。该方法利用激光共聚焦显微镜方法来检测肿瘤细胞表面的异位表达，可以准确得到肿瘤细胞表面的异位表达分子，该分子即为靶标分子，为Vγ9δ2T细胞新型靶标的候选分子，在通过对靶标分子封闭、构建缺陷型细胞和过量表达后检测Vγ9δ2T细胞的杀伤作用来进一步地确定靶标分子是否为目标新型靶标。该方法可以快速准确地得到Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标，这为了解Vγ9δ2T细胞的杀伤机制和肺鳞状上皮细胞癌的过继免疫治疗提供了新的思路和理论依据。附图说明图1为本专利技术实施例2中激光共聚焦显微镜术检测NCI-H520细胞表面hMSH2的异位表达；图2为本专利技术实施例3中抗体封闭杀伤实验验证异位表达的膜hMSH2介导Vγ9δ2T细胞对NCI-H520的识别杀伤；图3A为本专利技术实施例4中荧光转染对照监测hMSH2基因靶向siRNA的转染效率；其中，NC：NCI-H520细胞自然培养对照；TC：NCI-H520细胞RedOligo平行转染对照；siRNA：hMSH2基因靶向特异性siRNA转染的NCI-H520细胞；图3B为本专利技术实施例4中siRNAI，siRNAII显著下调hMSH2基因在NCI-H520细胞中的mRNA转录水平结果图；图3C为本专利技术实施例4中激光共聚焦显微镜术显示siRNA转染显著下调hMSH2蛋白在NCI-H520细胞膜的异位表达；图3D为本专利技术实施例4中siRNAI，siRNAII显著下调了hMSH2介导的Vγ9δ2T细胞对NCI-H520的识别杀伤结果图；图4A为本专利技术实施例5中用于hMSH2蛋白过表达的Fugw-EGFP表达载体；图4B为本专利技术实施例5中流式细胞术显示Fugw-EGFP-hMSH2过表达NCI-H520肺癌模式细胞表面hMSH2的表达较野生型显著升高；图4C为本专利技术实施例5中hMSH2过表达显著增强了Vγ9δ2T细胞对NCI-H520肺癌模式细胞的杀伤作用；图5A为本专利技术实施例6中流式细胞术检测效应Vγ9δ2T细胞，与野生型NCI-H520及hMSH2过表达NCI-H520共孵育Vγ9δ2T细胞细胞表面CD69，CD107a，Fas/FasL等分子的表达；图5B为本专利技术实施例6中流式细胞术检测效应Vγ9δ2T细胞，与野生型NCI-H520及hMSH2过表达NCI-H520共孵育Vγ9δ2T细胞表面Perforin，GranzymeA，GranzymeB的表达；图6A为本专利技术实施例6中流式细胞术检测效应Vγ9δ2T细胞，与野生型NCI-H520及hMSH2过表达NCI-H520共孵育Vγ9δ2T细胞表面IFN-γ及TNF-α的表达；图6B为本专利技术实施例6中ELISA检测hMSH2过表达NCI-H520与Vγ9δ2T细胞共孵育上清中IFN-γ及TNF-α的表达；图6C为本专利技术实施例6中siRNAI，siRNAII-hMSH2基因敲除对Vγ9δ2T细胞分泌IFN-γ的影响。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。一种鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，包括以下步骤：针对靶标分子进行如下a)-c)的操作：a)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子封闭的肿瘤细胞的杀伤作用；b)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子缺陷型的肿瘤细胞的杀伤作用；c)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子过表达的肿瘤细胞的杀伤作用；靶标分子通过激光共聚焦显微镜方法鉴定肿瘤细胞表面异位表达得到。该方法利用激光共聚焦显微镜方法来检测肿瘤细胞表面的异位表达，可以准确得到肿瘤细胞表面的异位表达分子，该分子即为靶标分子，为Vγ9δ2T细胞新型靶标的候选分子，在通过对靶标分子封闭、构建缺陷型细胞和过量表达后检测Vγ9δ2T细胞的杀伤作用来进一步地确定靶标分子是否为目标新型靶标。该方法可以快速准确的得到Vγ9δ2T细胞识别与杀伤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对靶标分子进行如下a)‑c)操作：a)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子封闭的肿瘤细胞的杀伤作用；b)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子缺陷型的肿瘤细胞的杀伤作用；c)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子过表达的肿瘤细胞的杀伤作用；所述靶标分子通过激光共聚焦显微镜方法鉴定肿瘤细胞表面异位表达得到。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别基于Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对靶标分子进行如下a)-c)操作：a)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子封闭的肿瘤细胞的杀伤作用；b)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子缺陷型的肿瘤细胞的杀伤作用；c)检测Vγ9δ2T细胞对靶标分子过表达的肿瘤细胞的杀伤作用；所述靶标分子通过激光共聚焦显微镜方法鉴定肿瘤细胞表面异位表达得到。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)和b)中所述的杀伤作用显著降低，所述靶标分子为Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，c)中所述的杀伤作用显著提升，所述靶标分子为Vγ9δ2T细胞识别与杀伤肺鳞状上皮细胞癌的新型靶标。4.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：代玉梅，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：广东,44