利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，包括：将重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303‑1加入到桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414培养体系中，于20‑30℃混合发酵培养2‑5天，培养完成后，收集桦褐孔菌CFCC 83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。本发明专利技术方法利用重组酿酒酵母‑桦褐孔菌混菌体系直接转化葡萄糖合成白桦脂酸，制备方法简单，周期短，后期处理方便，能有效提高桦褐孔菌转化生成白桦脂酸的得率，为桦褐孔菌中白桦脂酸合成调控及工业化生产提供了一种新的思路。

【技术实现步骤摘要】
利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法。
技术介绍
白桦脂酸(Betulinicacid，简称BA)是一类五环羽扇烷型的三萜化合物。近年来的研究表明，BA具有多种多样的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤和抗HIV方面，特别是针对黑色素肿瘤细胞具有专一的杀死作用，因此得到了广泛关注。更重要的是BA衍生物抗HIVII期临床实验已经取得成功，所以BA目前已被认为是最具潜力的药物先导化合物之一。最近，大量的体内外实验证明白桦脂酸还具有其他临床功能。白桦脂酸可以减缓乙醇诱导的肝星状细胞的激活，通过抑制肝葡萄糖的产生来缓解高血糖症，增强免疫应答，通过抑制胰脂肪酶达到减肥的效果，还可以保护心肌免受由于缺血再灌注引起的损伤以及有助于治疗化学性的甲状腺功能低下症。目前BA的制备方法，主要有以下三种：1天然提取法，2化学合成法，3微生物转化法。目前，白桦脂酸植物提取的主要来源是白桦树皮，但其中BA含量很低，仅为0.025％～2％。天然提取法虽然方法简单，但是BA在植物中的含量很少，因此对原料的消耗极大，杂质较多，产率低下，还没有潜在的工业化价值。白桦脂酸早在1938年已被化学合成，均是以白桦脂醇为原料，经过一系列氧化还原反应最终生成白桦脂酸。目前，化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然合成效果较好，但存在操作复杂、污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中的应用，有待进一步改善提高。微生物转化法是利用生物在代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物催化反应得到目标产物。与化学合成方法相比，微生物转化具有高立体选择性、反应条件温和、污染小、费用低，这种方法具有工业化的潜力。目前有几种真菌已被证实可以完成白桦脂醇到白桦脂酸转化，分别为Armillarialuteo-virensSaccZJUQH100-6、Cunninghamellablakesleeana、AspergillusfoetidusZU-G1和AspergillusoryzaeAS3.498，但产率仍然不能满足商业化需求。代谢工程和合成生物学的快速发展为在微生物宿主内获得高产的天然产物提供了很好的解决方法，但现在很少有将这些技术应用到白桦脂醇的转化方面的研究。白桦脂醇转化生成白桦脂酸是C28位的羟基氧化为羧基，可通过基因工程的手段将具有C28位氧化功能的基因与相应的还原酶基因导入酿酒酵母完成转化。目前，已发现的具有C-28位氧化功能的基因有来自Medicagotruncatula的CYP716A12，Vitisvinifera的CYP716A15，Panaxginseng的CYP716A52v2和Catharanthusroseus的CYP716AL1。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，提高了桦褐孔菌生物转化合成白桦脂酸的得率。一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸的方法，包括：将重组酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303-1加入到桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414培养体系中，于20-30℃混合发酵培养2-5天，培养完成后，收集桦褐孔菌CFCC83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。所述重组酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303-1b保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2015662，保藏日期为2015年11月5日。授权公告号CN105385614B的专利技术专利“一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用”中公开了所述的重组酿酒酵母及其构建方法，该重组酿酒酵母含有蒺藜状苜蓿CYP716A12和拟南芥ATR1基因，能同时表达CYP716A12氧化酶和ATR1还原酶，此CYP716A12基因和ATR1基因克隆于双向表达载体质粒pESC-URA上。所述桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC83414，保藏时间2007年7月30日。所述重组酿酒酵母ZJUQH311可以采用经活化、诱导的活酵母菌体或破碎酵母菌体。作为优选，采用破碎酵母菌体，破碎酵母可以促进单位质量桦褐孔菌CFCC83414中白桦脂酸含量的积累，且加入的酵母量越高，白桦脂酸的含量越高。所述破碎酵母菌体可通过如下方法制备：将经活化、诱导的重组酿酒酵母ZJUQH311用TEK缓冲液稀释，于300-400W条件下冰浴超声10-20min，得到破碎酵母菌体。所述桦褐孔菌CFCC83414培养体系为经过预培养的桦褐孔菌CFCC83414液体培养体系。所述预培养方法为：将活化的桦褐孔菌CFCC83414加入液体培养基，在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养2-5天。作为优选，所述重组酿酒酵母W303-1在桦褐孔菌CFCC83414培养体系中的加入量为102-108cfu/mL。加入该添加量的破碎酵母菌体，能有效提高桦褐孔菌的生物量及对白桦脂酸的转化得率。所述后处理包括将菌体破碎后用乙酸乙酯萃取，同时将发酵液用乙酸乙酯萃取，分别浓缩，得到白桦脂酸。本专利技术利用重组酿酒酵母-桦褐孔菌混菌体系直接转化葡萄糖合成白桦脂酸，制备方法简单，周期短，后期处理方便，能有效提高桦褐孔菌转化生成白桦脂酸的得率，产量最高达到19.52μg，单位质量桦褐孔菌中白桦脂酸含量与对照组相比最高提高145.5％，为桦褐孔菌中白桦脂酸合成调控及工业化生产提供了一种新的思路。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1混菌体系对桦褐孔菌生物量的影响(1)将桦褐孔菌CFCC83414接种到斜面上，在20-30℃的培养箱中培养12-18天左右，待其长满整个斜面。每一个月更新一次斜面。(2)每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌。在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养。(3)将诱导获得的工程酵母菌株接种、活化，诱导培养。(4)如表1所示，分为直接加入活酵母和加入破碎的酵母菌体进行混合发酵。直接加入酵母组：将诱导取得的工程酵母计数，一部分用生理盐水进行洗涤，稀释成109、107、105个/mL三个梯度的菌液，然后各取0.1mL加入到发酵了两天的100mL桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的工程酵母菌总量分别为108、106、104cfu。加入破碎后的酵母组：将诱导获得的工程酵母，取一部分于2000g离心5-10min，将沉淀菌体重悬于1mL的TEK缓冲液中，稀释成105、107、109cfu/mL三个梯度，于300-400W的条件下冰浴超声10-20min。然后各取0.1mL加入到发酵了两天的100mL桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的破碎工程酵母总量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，其特征在于，包括：将重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303‑1加入到桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414培养体系中，于20‑30℃混合发酵培养2‑5天，培养完成后，收集桦褐孔菌CFCC 83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。

【技术特征摘要】
1.一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，其特征在于，包括：将重组酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303-1加入到桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414培养体系中，于20-30℃混合发酵培养2-5天，培养完成后，收集桦褐孔菌CFCC83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。2.如权利要求1所述利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母W303-1为经活化、诱导的活酵母菌体或破碎酵母菌体。3.如权利要求1所述利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母W303-1为经活化、诱导的破碎酵母菌体。4.如权利要求2或3所述利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，其特征在于，所述破碎酵母菌体通过如下方法制备：将经活化、诱导的重组酿酒酵母ZJUQH311用TEK缓冲液稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，顾頔，李豪，胡竞进，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33