一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，把人工改造的Bt‑cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证和PCR验证后，再经测序验证后，获得Bt‑cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25；再用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到2个阳性抗性芽，再经过3轮叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt‑cry1C基因山新杨植株。本发明专利技术得到的质体转Bt‑cry1C基因山新杨对美国白蛾幼虫是高致死的，由此获得了一种高抗美国白蛾质体转Bt基因杨树新品种。

【技术实现步骤摘要】
一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：杨树(PopulusL.)是杨属的植物，全属有约100多种，是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国约62种(包括6杂交种)，其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系。在中国分布范围跨北纬25°～53°，东经76°～134°，遍及东北、西北、华北和西南等地。杨树是一种重要的经济林木和模式木本植物。杨树因速生丰产、实用性强、分布广、无性繁殖能力强，且基因组较小而成为研究林木生理和利用基因工程方法进行遗传改良的理想模式植物。杨树也是一种重要的可再生资源，杨木的用途很广。另外，杨树对环境保护也很重要，包括土地重新造林和污染土壤植物修复。我国是世界上木材及木制品的生产大国，同时也是一个消费大国。人均占有森林资源很少的国家，1998年实施了天然林保护工程，使得我国木材供需矛盾更加突出。所以，种植杨树，不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。现我国已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。对于我国来说，大力发展转基因杨树具有重大的意义，但由于杨树具有生长周期长、树体高大等特点以及杨树人工林容易发生大规模的虫害，而导致杨树发生虫害的害虫大多数是食叶类的害虫，危害杨树的鳞翅目害虫种类最多，有15科41种，以美国白蛾、春尺蠖食叶危害最大，舟蛾科、尺蛾科种类最为丰富，其中美国白蛾和杨扇舟蛾的幼虫危害最为严重。杨树虫害尤其对3年龄之内的杨树危害更大，极大地限制了杨树传统育种和栽培工作的开展。利用基因工程技术培育抗虫杨树品种已成为研究的热点之一。为了解决我国林木短缺，加快人工林的发展，急需进行优良抗虫杨树品种的开发和利用，在2001年批准了2种转Bt杨树可以进行商业化种植，分别是转Bt-cry1A基因的黑杨(Populusnigra)和转Bt-cry1Ac基因和API(慈姑蛋白酶抑制剂)基因的741杨[P.alba(P.davidiana×P.simonii)×P.tomentosa]，使我国成为唯一批准转基因杨树商业化种植的国家，目前，已有近22个抗虫杨树品种获准进行小规模田间试验、环境释放或中试生产，出于对转基因商业化的慎重，我国没有再批准新的商业杨树品种。山新杨是一种优良的杨树品种，它以采自嫩江县高峰林场山杨为母本，父本新疆杨来源于乌鲁木齐，于1964年进行杂交组合，经20年栽培试验，表现良好，性状稳定。适应性强，抗逆性好，常用于防风固沙。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，果序自然脱落且不飞絮。近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，而山新杨的繁殖是无性繁殖、不飞絮等特点，使其质体转基因更安全。用质体转基因技术转抗虫基因到杨树质体中，既能够达到相应的抗虫效果，又增加了生物安全性。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术的杨树质体抗虫性能差，导致杨树利用短缺。在抗虫性能，核转Bt基因杨树比质体转Bt基因杨树差，导致杨树利用短缺。在基因的表达量方面，核转Bt基因杨树中Bt蛋白的表达量大多数较低，而且在杨树的各个组织中都有表达，在杨木中积累量较高。核转Bt基因整合存在不确定性，容易造成位置效应。在生物安全性方面，核转Bt基因杨树容易通过花粉使基因逃逸，农杆菌介导的转化容易造成带有Bt基因的农杆菌逃逸。解决上述技术问题的难度：目前所有的转Bt基因杨树均为核转基因，核转基因的缺点，如基因整合位点的不确定性、表达量不稳定和基因逃逸等，这些缺点目前较难克服。解决上述技术问题的意义：而与核转基因相比，质体转基因较好的解决了这些问题，如定点整合到叶绿体基因组中；表达产物固定在叶绿体中；母系遗传方式，不会通过花粉传播外源基因；基因表达量大都较高。这些优点使得质体转基因生物安全性更高。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。本专利技术是这样实现的，一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：将Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切、PCR和测序验证后，获得Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25质粒；用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southernblot检验得到阳性抗性芽，再经过叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt-cry1C基因山新杨植株。进一步，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法具体包括：步骤一，质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，用cry1C-F和cry1C-R这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增得到cry1C基因片段，然后把该基因片段克隆到平末端载体Simple上构建质粒pYY23；用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切pYY23质粒DNA后得到的小片段与用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把经测序验证正确的重组子命名为pYY25，即为质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体；步骤二，转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定：用0.6μm的金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪法导入山新杨基因组中，在含30mg/L壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选抗性芽，阳性芽在含30mg/L壮观霉素的PaSIM2培养基上经过2-4轮的抗性筛选得到同质化的阳性芽，通过Southernblot检测阳性芽和达到同质化的阳性芽；通过筛选获得了2株同质化的阳性芽，把此阳性芽进一步的培养得到质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗。进一步，步骤二后，还需进行：质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析:把得到的2株同质化的质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗经过炼苗后，移栽到温室中生长。进一步，质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析后，还需进行：转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析:用Bt-cry1C蛋白ELISA检测试剂盒检测山新杨野生型和转基因山新杨植株上幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、根、表皮和木质部的样品中Bt蛋白的含量；进一步，转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析后，还需进行：转Bt-cry1C基因山新杨抗虫试验:山新杨野生型叶片和转Bt-cry1C基因山新杨叶片对美国白蛾的喂食试验。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术公开了通过基因枪转化法把人工改造的Bt-cry1C基因导入山新杨叶绿体基因组中，通过抗性筛选获得高抗美国白蛾的质体转Bt-cry1C基因山新杨植株。首先，把人工改造的Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证和PCR验证后，再经测序进一步验证后，获得了Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体，命名为pYY25。再用金粉包裹p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：将Bt‑cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切、PCR和测序验证后，获得Bt‑cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25质粒；用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到阳性抗性芽，再经过叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt‑cry1C基因山新杨植株。

【技术特征摘要】
1.一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：将Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切、PCR和测序验证后，获得Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25质粒；用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southernblot检验得到阳性抗性芽，再经过叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt-cry1C基因山新杨植株。2.如权利要求1所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法具体包括：步骤一，质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，用cry1C-F和cry1C-R这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增得到cry1C基因片段，然后把此基因片段克隆到平末端载体-BluntSimple上构建质粒pYY23；用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切pYY23质粒DNA后得到的小片段与用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把经测序验证正确的重组子命名为pYY25，即为质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体；步骤二，转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定：用0.6μm的金粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江，武江峰，武玉永，马美琪，徐乐天，常玲，李圣纯，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42