高粱成熟种子转基因方法技术

高粱成熟种子转基因方法，具有以下步骤：将饱满成熟的高粱种子进行无菌处理；将种子吸干表面水分后接种到诱导培养基中诱导愈伤组织；将愈伤组织去芽后转入继代培养基中培养，再将其接种于渗透培养基中培养；将金粉涡旋至无沉淀，加入含有目的基因的质粒，涡旋，然后加入CaCl2和亚精胺涡旋后静置，离心后去上清液，再加乙醇涡旋后静置，再次离心后去上清液，获得微弹；将步骤微弹加无水乙醇溶解，吸取到载体膜上，将载体膜及愈伤组织放入基因枪中，对愈伤组织进行轰击，轰击后的愈伤组织在渗透培养基上培养后转移到休息培养基上培养，获得转基因愈伤组织；将转基因愈伤组织转入分化培养基中培养，获得转基因再生苗。本发明专利技术可成功转化目的基因。

【技术实现步骤摘要】
高粱成熟种子转基因方法
本专利技术涉及育种、育苗技术，具体地说是一种高粱成熟种子转基因方法。
技术介绍
高粱育种研究面临品种遗传变异性小、遗传力低、品种改良耗时长等问题，与其他具有重要经济价值的禾谷类作物，如水稻、小麦、玉米等相比，由于其高频再生和高效转化体系较难建立，因此其遗传转化研究工作发展较为缓慢。目前，以幼胚为外植体进行高粱遗传转化的研究工作，是进行的最早、最多、也是最成功的。但获取幼胚费时、费力，同时受季节、地域的限制，每年只能有3个月时间有幼胚供给，很难保证充足而稳定的外植体供应。与幼胚相比，以高粱成熟种子为外植体进行培养更便于操作，且不受时间限制。因此，建立高粱成熟种子的转基因体系对于高粱的遗传育种和基因功能研究具有非常重要的意义。迄今为止，国内外均未见建立高粱成熟种子转基因体系的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高粱成熟种子转基因方法，该方法不需要建立温室和分期播种，并能够成功的将目的基因转入高粱中。为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：高粱成熟种子转基因方法，其特征在于具有以下步骤：(1)、将饱满成熟的高粱种子进行无菌处理；(2)、将步骤(1)处理后的种子吸干表面水分后接种到诱导培养基中，25-30℃黑暗培养10-18天，诱导愈伤组织；(3)、将步骤(2)诱导得到的愈伤组织去芽后转入继代培养基中，25-30℃黑暗培养7-14天，再将愈伤组织接种于渗透培养基中培养1-5小时，备用；(4)、将浓度为40-60mg/mL的50μL金粉涡旋至无沉淀，加入含有目的基因的质粒8-12μL，涡旋1-2min，然后加入2-3MCaCl240-60μL和0.05-0.15M亚精胺20μl，涡旋1-2min后静置4-8min，离心后去上部的澄清液体，再加120-140μL75％乙醇涡旋1-2min，静置4-8min，再次离心后去上部的澄清液体，获得含有目的基因的微弹；(5)、将步骤(4)获得的微弹加30-40μL无水乙醇溶解，吸取5-10μL到载体膜上，将载体膜及步骤(3)准备好的愈伤组织放入基因枪中，以压强800-1300psi、轰击距离6cm或9cm或12cm对愈伤组织进行轰击，轰击后的愈伤组织在渗透培养基上培养2-6小时后转移到休息培养基上培养2-5天，获得转基因愈伤组织；(6)、将步骤(5)获得的转基因愈伤组织转入分化培养基中，25-30℃，每天以光照强度1400-1800lx光照12-16小时、黑暗8-12小时，培养25-35天，获得转基因再生苗。进一步地，上述方案中，所述的诱导培养基为MS培养基，另含天冬氨酸0.1-2g/L，脯氨酸0.1-2g/L，VB10.01-0.2mg/L，VB60.1-0.8mg/L，Vc1-20mg/L，2,4-D1-20mg/L，CuSO40.5-5mg/L。进一步地，上述方案中，所述的继代培养基为MS培养基，另含天冬氨酸0.1-2g/L，脯氨酸0.1-2g/L，VB10.01-0.2mg/L，VB60.1-0.8mg/L，Vc1-20mg/L，2,4-D1-20mg/L，CuSO40.5-5mg/L，步骤(3)中所述的渗透培养基为MS培养基，另含山梨糖醇0.02-0.5mol/L、甘露醇0.02-0.5mol/L。进一步地，上述方案中，所述的渗透培养基为MS培养基，另含山梨糖醇0.02-0.5mol/L、甘露醇0.02-0.5mol/L；所述的休息培养基为MS培养基，另含天冬氨酸0.1-2g/L，脯氨酸0.1-2g/L，Vc1-20mg/L，2,4-D1-10mg/L。进一步地，上述方案中，所述的分化培养基为MS培养基，另含0.1-10mg/L的IAA、0.1-10mg/L的6-BA、0.1-10mg/L的TDZ及潮霉素20-50mg/L或草甘膦1-10mg/L或G41820-50mg/L。上述方案的步骤(6)完成后，在转基因再生苗为3-4cm时进行生根培养，根长出后加水，28℃下，每天以光照强度1500lx光照14小时、黑暗10小时，培养3天，然后，将根部洗净移栽至蛭石与营养土按1:1混合的营养钵中，28℃下，每天以光照强度1500lx光照14小时、黑暗10小时炼苗，3天后移至田间。。本专利技术能够将动物、植物和微生物基因转入高粱中，可利用本技术进行高粱基因功能的研究，并可培育优质、高产、多抗、高效的高粱转基因新品种。相比于利用幼胚为外植体的高粱转基因方法，本方法具有不受时间限制的显著优点。另外，利用幼胚为外植体的高粱转基因方法为了能够持续获得幼胚，一般需要建立温室，并分期播种，而本方法不需要建立温室和分期播种，因此，极大地简化了高粱转基因的程序、节省了高粱转基因的花费，减少了转基因过程所需时间。附图说明图1是本专利技术实施例一中的愈伤组织GUS染色结果图；图2是本专利技术实施例二中的To植株PCR检测结果图；图3是本专利技术实施例二中GFP转基因愈伤及植株根部压片图。具体实施方式以下结合实施例及附图进一步说明本专利技术。实例1本实施例以1305-NPTⅡ和GUS(β-D-葡糖醛酸酶)的质粒为目的基因，具有以下步骤。1、将饱满成熟的高粱32号种质进行无菌处理。处理的方法为，取30-50粒高粱种子用75％乙醇完全浸没，振荡5min后取出，用灭菌水冲洗一次，然后将高粱种子加入至10mL升汞中，滴加2滴Tween20，振荡15min，灭菌水清洗5次。2、将步骤1处理后的种子吸干表面水分后接种到20mL诱导培养基中，28℃黑暗培养14天，诱导愈伤组织。诱导培养基为MS培养基，另含天冬氨酸1g/L，脯氨酸1g/L，VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，Vc10mg/L，2,4-D5mg/L，CuSO42mg/L。3、将步骤2获得的愈伤组织去芽后转入20mL继代培养基中，28℃黑暗培养7-14天，再将愈伤组织接种于20mL渗透培养基中培养1-2小时，备用。继代培养基为MS培养基，另含天冬氨酸1g/L，脯氨酸1g/L，VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，Vc10mg/L，2,4-D5mg/L，CuSO42mg/L。渗透培养基为MS培养基，另含山梨糖醇0.2mol/L、甘露醇0.2mol/L。4、微弹制备：将直径为6μm、浓度为50mg/mL的50μL金粉涡旋至无沉淀，加入含有目的基因1305-NPTⅡ和GUS的质粒10μL(1305-NPTII和GUS各为5μL)，涡旋1-2min，然后立即加入2.5MCaCl250μL和0.1M亚精胺20μL，涡旋1-2min后冰上静置5min，离心后去上部的澄清液体，再加130μL75％乙醇涡旋1-2min，冰上静置5min，再次离心后去上部的澄清液体，获得含有1305-NPTⅡ和GUS质粒的微弹；5、将步骤4获得的微弹加35μL无水乙醇溶解，吸取5μL到载体膜上，将载体膜及步骤3准备好的愈伤组织放入基因枪中，以压强1100psi、轰击距离12cm对愈伤组织进行轰击，轰击后的愈伤组织在20mL渗透培养基上培养3-4小时后转移到20mL休息培养基上培养3天，获得转基因愈伤组织。渗透培养基为MS培养基，另含山梨糖醇0.2mol/L、甘露醇0.2mol/L，休息培养基为MS培养基，另含天冬氨酸1g/L，脯氨酸1g/L，Vc10mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高粱成熟种子转基因方法，其特征在于具有以下步骤：(1)、将饱满成熟的高粱种子进行无菌处理；(2)、将步骤(1)处理后的种子吸干表面水分后接种到诱导培养基中，25‑30℃黑暗培养10‑18天，诱导愈伤组织；(3)、将步骤(2)诱导得到的愈伤组织去芽后转入继代培养基中，25‑30℃黑暗培养7‑14天，再将愈伤组织接种于渗透培养基中培养1‑5小时，备用；(4)、将浓度为40‑60mg/mL的50μL金粉涡旋至无沉淀，加入含有目的基因的质粒8‑12μL，涡旋1‑2min，然后加入2‑3M CaCl2 40‑60μL和0.05‑0.15M亚精胺20μl，涡旋1‑2min后静置4‑8min，离心后去上部的澄清液体，再加120‑140μL 75％乙醇涡旋1‑2min，静置4‑8min，再次离心后去上部的澄清液体，获得含有目的基因的微弹；(5)、将步骤(4)获得的微弹加30‑40μL无水乙醇溶解，吸取5‑10μL到载体膜上，将载体膜及步骤(3)准备好的愈伤组织放入基因枪中，以压强800‑1300psi、轰击距离6cm或9cm或12cm对愈伤组织进行轰击，轰击后的愈伤组织在渗透培养基上培养2‑6小时后转移到休息培养基上培养2‑5天，获得转基因愈伤组织；(6)、将步骤(5)获得的转基因愈伤组织转入分化培养基中，25‑30℃，每天以光照强度1400‑1800lx光照12‑16小时、黑暗8‑12小时，培养25‑35天，获得转基因再生苗。...

【技术特征摘要】
1.高粱成熟种子转基因方法，其特征在于具有以下步骤：(1)、将饱满成熟的高粱种子进行无菌处理；(2)、将步骤(1)处理后的种子吸干表面水分后接种到诱导培养基中，25-30℃黑暗培养10-18天，诱导愈伤组织；(3)、将步骤(2)诱导得到的愈伤组织去芽后转入继代培养基中，25-30℃黑暗培养7-14天，再将愈伤组织接种于渗透培养基中培养1-5小时，备用；(4)、将浓度为40-60mg/mL的50μL金粉涡旋至无沉淀，加入含有目的基因的质粒8-12μL，涡旋1-2min，然后加入2-3MCaCl240-60μL和0.05-0.15M亚精胺20μl，涡旋1-2min后静置4-8min，离心后去上部的澄清液体，再加120-140μL75％乙醇涡旋1-2min，静置4-8min，再次离心后去上部的澄清液体，获得含有目的基因的微弹；(5)、将步骤(4)获得的微弹加30-40μL无水乙醇溶解，吸取5-10μL到载体膜上，将载体膜及步骤(3)准备好的愈伤组织放入基因枪中，以压强800-1300psi、轰击距离6cm或9cm或12cm对愈伤组织进行轰击，轰击后的愈伤组织在渗透培养基上培养2-6小时后转移到休息培养基上培养2-5天，获得转基因愈伤组织；(6)、将步骤(5)获得的转基因愈伤组织转入分化培养基中，25-30℃，每天以光照强度1400-1800lx光照12-16小时、黑暗8-12小时，培养25-35天，获得转基因再生苗。2.根据权利要求1所述的高粱成熟种子转基因方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的诱导培养基为MS培养基，另含天冬氨酸0.1-2g/L，脯氨酸0.1-2g/L，VB10.01-0.2mg/L，VB60.1-0.8m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽华，李杰勤，高丽，王臣臣，刘言龙，詹秋文，纪康伟，
申请(专利权)人：安徽科技学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34