在配对的颊粘膜拭子和尿液样本中使用微卫星分析进行膀胱癌检测制造技术

本申请公开了高效精确检测膀胱癌的方法。特别地，所述方法使用膀胱癌标记物的微卫星分析利用来自患者的匹配的颊粘膜拭子和尿液样本以确定杂合性丢失或微卫星不稳定性的存在情况。在一些癌症标记物分组中，检测到的在两个标记物中的杂合性丢失或微卫星不稳定性可以指示患有膀胱癌。

Detection of bladder cancer using microsatellite analysis in matched buccal swabs and urine samples

This application discloses an efficient and accurate method for detecting bladder cancer. In particular, the method uses microsatellite analysis of bladder cancer markers using matched buccal swabs and urine samples from patients to determine the presence of loss of heterozygosity or microsatellite instability. In some cancer marker groupings, loss of heterozygosity or microsatellite instability detected in both markers can indicate bladder cancer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在配对的颊粘膜拭子和尿液样本中使用微卫星分析进行膀胱癌检测相关申请的交叉引用本申请基于2015年12月8日提交的美国临时专利申请号62/264,504的公开内容，并且要求上述申请提交日期的优先权，其全部公开内容在此通过引用并入本申请。专利
本申请公开了可用于检测膀胱癌的组合物和方法。专利技术背景膀胱癌在美国男性和女性中分别是第4常见和第7常见的恶性肿瘤。在美国男性和女性中，每年分别诊断出60,000和18,000起膀胱癌的新病例。大约75％的患者患有该疾病的浅表型，并且这些患者的15％处于该疾病发展成侵袭型的风险。大约70％患有该疾病的浅表型的患者在10年内经历疾病复发，其中大多数的复发在初始诊断后的两年内检测到。由于这些原因，患有该疾病的浅表型的患者需要对疾病发展和复发进行监测。目前，膀胱癌监控的护理标准包括持续两年、每三个月一次的膀胱镜检查和尿细胞学检查，随后每年一次膀胱镜检查、尿细胞学检查和上尿路的X射线评估。然而，由于细胞学检查的灵敏度和特异性分别为仅25-50％和90-100％，这种监控方法并不是最优的。尽管膀胱镜检查的灵敏度较高(90-100％)，这一程序收费昂贵，需要复杂的仪器以及无菌环境。而且，由于其侵入性的性质，这一程序具有固有的损伤、并发症和感染的风险。因此，需要既灵敏又对膀胱癌具有特异性的，并且与其他检测方法相比具有较低的并发症的风险的检测膀胱癌的方法。本申请公开的方法和试剂盒涉及上述的以及其他的重要需求。专利技术简述特别地，为了应对上述未满足的需求，本申请公开了在受试者中检测杂合性丢失的方法，包括：从膀胱样本和匹配的对照样本中扩增微卫星标记物的组以产生扩增产物的组，其中所述标记物的组包括FGA、D9S747、MBP、D9S162、THO1、IFN-A、D21S1245和D20S48；检测所述扩增产物；比较来自所述膀胱样本的扩增产物和来自所述匹配的对照样本的扩增产物；和在所述膀胱样本中确定杂合性丢失是否存在于任意一个所述标记物中。还提供了在受试者中检测膀胱癌的方法，包括：使用本申请所述的引物从膀胱样本和对照样本中扩增微卫星标记物的组；检测所述反应产物；和在所述膀胱样本中确定是否多于一个的所述微卫星标记物展现出杂合性丢失或微卫星不稳定性，其中在至少两个微卫星标记物中展现杂合性丢失或不稳定性指示患有膀胱癌。本申请还公开了试剂盒，其包括具有特定核酸序列的引物以及所述引物的包装。附图简述结合附图阅读时，将进一步地理解该简述以及以下详述。为了说明公开的方法和试剂盒的目的，附图中示出了所述方法和试剂盒的示例性的实施方式；然而，所述方法和试剂盒不限于公开的具体实施方式。在附图中：图1显示了IFN-A基因座处的LOH；图2显示了对D9S171基因座中另外的等位基因的检测；图3显示了在D16S476基因座中检测到的人工信号；图4提供了显示在STR标记物处的LOH的电泳图，所述STR标记物位于9q32处；图5提供了用于研究患有膀胱癌的受试者的特征和相关样品号的汇总；图6A示出了对照受试者N1的MSA数据；图6B示出了对照受试者N2的MSA数据；图6C示出了对照受试者N3的MSA数据；图6D示出了对照受试者N4的MSA数据；图6E示出了对照受试者N5的MSA数据；图6F示出了膀胱癌受试者C1的MSA数据；图6G示出了膀胱癌受试者C2的MSA数据；图6H示出了膀胱癌受试者C3的MSA数据；图6I示出了膀胱癌受试者C4的MSA数据；以及图6J示出了膀胱癌受试者C5的MSA数据。专利技术详述通过参照以下详细描述，结合附图(其构成本公开内容的一部分)，可以更加容易地理解公开的方法和试剂盒。应当理解，公开的方法和试剂盒不限于本申请描述和/或示出的具体的方法和试剂盒，并且本申请使用的术语是用于仅通过示例的方式描述特定实施方式的目的，而且不旨在对要求保护的方法和试剂盒进行限制。除非另外具体规定，否则关于可能的机制或作用模式或改进的理由的任何描述都仅仅是作为说明性的，并且公开的方法和试剂盒不会受到该建议的机制或作用模式或改进的理由的准确或错误的束缚。本说明书通篇涉及组合物和使用所述组合物的方法。当本公开描述或要求保护与组合物相关的特征或实施方式时，该特征或实施方式同样适用于使用所述组合物的方法。相似地，当本公开描述或要求保护与使用组合物的方法相关的特征或实施方式时，该特征或实施方式同样适用于所述组合物。在表达数值的范围时，另一实施方式包括从一个特定数值和/或至另一特定数值。另外，对以范围表述的数值的指代包括该范围内的每个数值。所有的范围都是包含性的以及可组合的。当以近似值表达数值时，通过使用前缀“约”，应当理解该特定数值构成另一实施方式。除非上下文另有明确规定，否则对特定数值的指代包括至少该特定数值。应当理解，在本申请中，为了明确起见而在不同的实施方式的上下文中描述的公开的方法和试剂盒的某些特征，也可以以组合的形式在单一实施方式中提供。相反地，为了简洁起见而在单一实施方式的上下文中描述的公开的方法和试剂盒的多个特征，也可以分别提供或以任何亚组合的形式提供。用于本申请中的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数形式。说明书和权利要求通篇使用多个涉及说明书各个方面的术语。除非另外指出，否则该术语应被赋予其在本领域中的常规含义。其他具体定义的术语应当以与本申请提供的定义一致的方式理解。用于本申请中的“微卫星”(与“简单序列重复(SSR)”和“短串联重复(STR)”可互换地使用)是指核酸片段，其具有由2至6个碱基对组成的碱基单位的连续重复。微卫星通常长度为100-400个碱基对。因此，如果微卫星的碱基单位是4个碱基对，则会有约25至100个碱基单位的连续重复。“微卫星的不稳定性”是指当错配修复(MMR)没有正常运作时，细胞中微卫星的核酸序列发生的变化。由于丧失了DNA聚合酶固有的纠正错配的校对能力，微卫星特有的重复单位容易出错。核酸碱基的插入或缺失的累积可导致框移突变，其对蛋白表达可造成有害的影响。聚合酶未检测到的错配错误由MMR纠正，因此MMR系统可以被视为一种失效保护系统。编码MMR系统的基因中的突变导致对微卫星复制缺乏监控，并且可导致不稳定性。已经将肿瘤抑制基因中发生的微卫星不稳定性与癌症表型相关联。术语“杂合性丢失”或LOH是指丢失一段DNA，其最有可能是一条染色体链而非另一条中的复制错误导致的。在一些癌症中，如果丢失的遗传材料编码全部或部分的肿瘤抑制蛋白、细胞繁殖机构或者细胞的稳定繁殖所必需的其他蛋白，则LOH可能是特别成问题的。尽管余下的拷贝可能足以防止由丢失的等位基因所造成的任何有害影响，但如果余下的拷贝不足以防止有害影响，或者如果余下的拷贝被诱变，使得编码的蛋白无法起到野生型蛋白的作用，则LOH可导致或至少促成癌症表型。余下的微卫星等位基因仍然易于突变，特别是在缺乏功能完整的MMR系统的细胞中更是如此，其可能得到进一步的产生无功能的蛋白的突变或变异，因此微卫星等位基因处的LOH可能与癌症相关。如果所述无功能的蛋白是肿瘤抑制物，则癌症表型的风险增加。除每年诊断出的大约80,000起膀胱癌的新病例之外，每年大约有12,000位男性和4,500位女性死于该疾病。由于该疾病在美国国内外的盛行，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在受试者中检测杂合性丢失的方法，包括：a)从膀胱样本和匹配的对照样本中扩增微卫星标记物的组以产生扩增产物的组，其中所述标记物的组包括FGA、D9S747、MBP、D9S162、THO1、IFN‑A、D21S1245和D20S48；b)检测所述扩增产物；c)比较来自所述膀胱样本的扩增产物和来自所述匹配的对照样本的扩增产物；和d)在所述膀胱样本中确定杂合性丢失是否存在于任意一个所述标记物中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.08 US 62/264,5041.一种在受试者中检测杂合性丢失的方法，包括：a)从膀胱样本和匹配的对照样本中扩增微卫星标记物的组以产生扩增产物的组，其中所述标记物的组包括FGA、D9S747、MBP、D9S162、THO1、IFN-A、D21S1245和D20S48；b)检测所述扩增产物；c)比较来自所述膀胱样本的扩增产物和来自所述匹配的对照样本的扩增产物；和d)在所述膀胱样本中确定杂合性丢失是否存在于任意一个所述标记物中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记物的组的扩增包括至少两个多重扩增反应。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标记物的组的扩增包括至少三个多重扩增反应。4.根据权利要求3所述的方法，其中第一多重反应扩增的模板包括标记物FGA和D9S747。5.根据权利要求3所述的方法，其中第二多重反应扩增的模板包括标记物D9162、MBP、IFN-A和THO1。6.根据权利要求3所述的方法，其中第三多重反应扩增的模板包括标记物D21S1245和D20S48。7.根据权利要求1所述的方法，其中使用引物对扩增各个标记物。8.根据权利要求7所述的方法，其中用荧光染料标记所述各对引物中的一个。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述各个标记的荧光染料具有不同的最大荧光发射波长。10.根据权利要求1所述的方法，其中使用遗传分析装置检测所述扩增产物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述遗传分析装置是琼脂糖凝胶。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述遗传分析装置利用毛细管电泳仪分离所述扩增产物并使用CCD照相机以检测来自所述产物发射的荧光。13.根据权利要求1所述的方法，其中在所述8个标记物中的2个中存在杂合性丢失指示患有膀胱癌。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述膀胱癌样本是尿样本。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述膀胱癌样本是膀胱活检样本。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述匹配的对照样本是血液、血清、颊细胞、毛囊、唾液、皮脂、皮肤、汗液或泪液。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述匹配的对照样本是颊细胞。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述微卫星标记物的组进一步包括D4S243、D17S654、D17S695、D16S310、D9S171和D16S476。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记物的组的扩增包括三个多重扩增反应。20.根据权利要求19所述的方法，其中第一多重反应扩增标记物D4S243、FGA、D9S747、D17S654和D17S695。21.根据权利要求19所述的方法，其中第二多重反应扩增标记物D9162、MBP、IFN-A、THO1和D16S310的标记物。22.根据权利要求19所述的方法，其中第三多重反应扩增标记物D21S1245、D20S48、D9S171和D16S476的标记物。23.一个试剂盒，其包括：引物，其包含核酸序列GACATCTTAACTGGCATTCATGG；引物，其包含核酸序列CTTCTCAGATCCTCTGACACTCG；引物，其包含核酸序列GCCATTATTGACTCTGGAAAAGAC；引物，其包含核酸序列CAGGCTCTCAAAATATGAACAAAAT；引物，其包含核酸序列GCAACCATTTATGTGGTTAGGG；引物，其包含核酸序列TCCCACAACAAATCTCCTCAC；引物，其包含核酸序列GGACCTCGTGAATTACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·穆恩，
申请(专利权)人：BCD创新公司，
类型：发明
国别省市：美国,US