白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定及其应用，利用本发明专利技术的制备方法得到了生物碱含量50％以上的白鲜皮活性部位，其制备工艺简单，采用有机溶剂充分萃取，易于操作，成本低廉。在体外实验中对人胃癌细胞株MGC‑803和SGC‑7901的生长具有很好的抑制作用；在动物实验中，白鲜皮活性部位对人SGC‑7901胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用，并且能显著提高荷瘤小鼠的生存率。因此该白鲜皮活性部位能用于制备抗胃癌药物，具有良好的开发应用前景。本发明专利技术还公开了该白鲜皮抗癌活性部位的含量测定方法及主成分范围，便于后期开发应用时，进行质量标准提升与控制。

Preparation method, content determination method and application of anticancer active fraction in fresh peel

The invention relates to a preparation method, content determination and application of anticancer active parts in fresh peel. The active parts of fresh peel with alkaloid content more than 50% are obtained by the preparation method of the invention. The preparation process is simple, the organic solvent is fully extracted, the operation is easy and the cost is low. In vitro, the growth of human gastric cancer cell lines MGC 803 and SGC 7901 was inhibited. In animal experiments, the active fraction of Radix Dioscoreae Alba inhibited the growth of human SGC 7901 gastric cancer cell xenografts in nude mice, and significantly increased the survival rate of tumor-bearing mice. Therefore, the active fraction of fresh peel can be used to prepare anti-gastric cancer drugs, and has a good prospect of development and application. The invention also discloses the content determination method of the anticancer active part of the fresh peel and the range of the principal components, so as to facilitate the improvement and control of the quality standard in the later development and application.

【技术实现步骤摘要】
白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用
本专利技术涉及一种具有抗癌活性的中药提取物，具体地说涉及白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定及其应用。
技术介绍
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。中草药在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起到不容忽视的作用，寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗肿瘤疾病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。白鲜皮主要成分：白鲜内酯、黄柏酮酸、胡芦巴碱、胆碱。白鲜碱、茵芋碱、崖椒碱、前茵芋碱、异斑沸林草碱、柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、菜油甾醇、茵芋碱、r-崖椒碱、白鲜明碱以及谷甾醇、酸性物质和皂甙等。功能主治：1，清热解毒，除湿止痒：用于湿热疮疹，多脓或黄水淋漓，肌肤湿烂，皮肤瘙痒及风疹疥癣。2，清热解毒除湿：用于治湿热黄疸及湿热痹证。
技术实现思路
本专利技术旨在对白鲜皮抗癌作用进行研究，进而发现白鲜皮抗癌作用的活性部位，并对白鲜皮抗癌活性部位的制备方法进行优化，得到具有较好抗癌活性的部位，并对该抗癌活性部位的主成分进行了含量测定。有鉴于此，本专利技术提供了一种白鲜皮中抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。进一步的，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、r-崖椒碱、白鲜明碱和前茵芋碱。本专利技术还提供了含有所述白鲜皮中抗癌活性部位在制备抗癌药物中的应用。进一步的，该活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。本专利技术还提供了一种包含该活性部位的药物组合物，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。进一步的，该药物组合物的剂型包括注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和合剂。本专利技术还提供了一种白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法，包含以下步骤：(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入乙醇水溶液回流提取3～5次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。(2)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，加稀酸将pH值调节至2～4，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至9～10后，用有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。(3)除杂：大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～3倍柱体积的体积分数为20～40％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3～5倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。(4)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为Agilent制备柱ZorbaxSB-C18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-A和0.1％三氟乙酸水溶液-B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-18min收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗癌活性部位。优选的，提取步骤中的乙醇溶液为70％～85％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比2.5～3倍量，加热回流时间为2～4小时，浸膏浓缩至无醇味。优选的，萃取步骤中水的用量为浸膏的2～3倍量，萃取用有机溶剂用量与水等体积。具体的，萃取步骤中稀酸为0.1％～l％的硫酸或盐酸溶液。具体的，萃取步骤中有机溶剂为二氯甲烷或氯仿。具体的，除杂步骤中大孔树脂柱型号为DH101。进一步的，纯化步骤为：将步骤(4)的制备液相色谱替换为硅胶柱层析，即将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用3～5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用3～6倍柱体积的体积比为98:2～85:15的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮抗癌活性部位。更进一步的，纯化步骤为：将步骤(4)的制备液相色谱替换为硅胶柱层析，即将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用6倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮抗癌活性部位。本专利技术还提供了一种白鲜皮中抗癌活性部位的主成分含量测定方法，包括以下步骤：(1)供试品制备：精密称取10.0mg白鲜皮中抗癌活性部位，用色谱纯甲醇溶解且定容至10ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到白鲜皮中抗癌活性部位供试品；(2)：对照品溶液制备：精密称定经干燥过的白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、崖椒碱和前茵芋碱对照品各5.0mg，置10mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成白鲜皮生物碱混合对照品储备液，-4℃冰箱放置，备用。(3)：对步骤(1)制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以步骤(2)制备的白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱对照品进行含量测定；HPLC条件为：色谱柱填料为AglientC18，规格为250mm×4.6mm5μm，波长为240nm，流速为10ml/min，柱温30℃；流动相为乙腈(A)-0.1％三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脱为：本专利技术的有益效果为：1.本专利技术的提取分离工艺能有效地除去易在制备色谱柱上形成死吸附的杂质，提高有效成分的含量，能快速准确的得到有效成分。2.本专利技术提供的白鲜皮有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。3.本专利技术提供的方法首次从白鲜皮药材中得到含白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱的总生物碱活性部位，并首次对其治疗胃癌的药效进行研究，由于成分确切，含量明确，制备工艺便捷，活性好，适宜开发成抗肿瘤中药新药。附图说明图1为本专利技术白鲜皮纯化步骤75％的乙醇水溶液洗脱部位制备液相图谱；图2为本专利技术白鲜皮抗癌活性部位的HPLC分析图。具体实施方式如前所述，本专利技术旨在提供一种白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用。以下将结合实施例的内容进行具体描述。特别需要指出的是，针对本专利技术所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本专利技术如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：一种白鲜皮抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。一种白鲜皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白鲜皮抗癌活性部位，其特征在于，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r‑崖椒碱和前茵芋碱。

【技术特征摘要】
1.一种白鲜皮抗癌活性部位，其特征在于，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。2.根据权利要求1所述的活性部位，其特征在于，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。3.根据权利要求1-2任一项所述的活性部位在制备抗癌药物中的应用。4.根据权利要求3所述的活性部位，其特征在于，该活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。5.根据权利要求1-2任一项所述一种白鲜皮抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入乙醇水溶液回流提取3～5次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。(2)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，加稀酸将pH值调节至2～4，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至9～10后，用有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。(3)除杂：大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～3倍柱体积的体积分数为20～40％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3～5倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。(4)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为Agilent制备柱ZorbaxSB-C18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-0.1％三氟乙酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从30％升为50％，30-47min，甲醇相从50％升为60％，47-60min，甲醇相从60％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-18分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗癌活性部位。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，提...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，刘贵栋，单林，
申请(专利权)人：哈尔滨职业技术学院，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23