一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术的阿克曼氏菌特异性筛选培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；利用本发明专利技术的阿克曼氏菌特异性筛选培养基对粪便进行阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的筛选，可使阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的阳性率高达70％。

A Specific Screening Medium for Ackermania and Its Preparation and Application

The invention discloses an Ackermania specific screening medium, a preparation method and application thereof, belonging to the field of microbial technology. The specific screening medium for Ackermania includes enrichment medium, separation medium and primary screening medium; the enrichment medium contains mucin as the sole carbon source; the separation medium contains broth of brain-heart leaching solution or broth containing mucin and brain-heart leaching solution; the primary screening medium contains broth of brain-heart leaching solution or mucin and brain-heart leaching solution; and the primary screening medium contains broth of brain-heart leaching solution or mucin and brain-heart leaching. The positive rate of Akkermania muciniphila can be up to 70% by using the specific screening medium of Akkermania according to the present invention to screen Akkermania muciniphila in feces.

【技术实现步骤摘要】
一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用，属于微生物

技术介绍
阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)是人体肠道菌之一，在人体肠道中的丰度较低，一般在3％以下。其从属于Akkermansia属、疣微菌门，为革兰氏阴性严格厌氧菌，无质粒；其生长要求较低的氧化还原电势，在有氧情况下不生长；且其可以肠道杯状细胞分泌的黏蛋白作为唯一的碳源、氮源和能源物质。目前，已经有研究表明，阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)在肠道中的丰度与多种生理病理状态相关，肥胖、糖尿病及肠炎人群肠道中的Akkermansiamuciniphila丰度会显著降低；动物实验也表明，补充Akkermansiamuciniphila可以缓解高脂膳食诱导的小鼠肥胖症状、急慢性酒精灌胃小鼠引起的肝脏炎症等；此外，Akkermansiamuciniphila已被证明与癌症PD-1免疫疗法的疗效相关，PD-1免疫疗法起作用的癌症患者粪便中含有更多的Akkermansiamuciniphila。因此，Akkermansiamuciniphila在糖尿病、酒精性及非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病的治疗以及提高肠道屏障功能、缓解炎症等方面均具有极大的应用前景，如何筛选出更多Akkermansiamuciniphila以供研究十分重要。Akkermansiamuciniphila最初是由荷兰瓦格宁根大学学者WillemdeVos团队分离得到(InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2004)，国内南方医科大学珠江医院彭永正教授团队也依靠瓦格宁根大学WillemdeVos团队的分离方法从中国南方人群中分离到22株Akkermansiamuciniphila菌株。这两个团队的分离方法为：先采用添加了经过纯化的猪胃蛋白的基础培养基作为富集培养基(使用富集培养基进行筛选分离的原理为富集培养基中含有黏蛋白作为唯一的碳源、氮源及能源物质，可使得Akkermansiamuciniphila在此培养基中大量增殖而其他肠道微生物因为不能降解黏蛋白而出现生长抑制)对稀释成各梯度的粪便进行富集培养，得到富集培养液；再选择出现浑浊的最低稀释梯度的富集培养液，以添加了0.75％NobleAgar的富集培养基作为分离培养基(使用分离培养基进行筛选分离的原理为分离培养基中含有黏蛋白作为唯一碳源、氮源及能源物质，可支持Akkermansiamuciniphila的生长)进行分离培养。然而，上述分离方法在实际操作过程中具有许多缺陷：首先，上述分离方法要求所有操作过程在无氧、充氮环境下进行且上述分离方法所使用的培养基要求提前进行气体置换除氧且所有操作过程均不能混入氧气，而多数实验室(尤其是国内实验室)仅配有厌氧工作站，并不具备前期气体置换除氧的装置，使得实验室在进行气体置换除氧时，需采用加热煮沸的方法，给Akkermansiamuciniphila的培养造成一定的困难；其次，上述分离方法中要求配置出的液体富集培养基澄清透明，以判断富集管是否有生长，但是，由于WillemdeVos团队及彭永正教授团队均只公开了其所用富集培养基的配方，并未公布富集培养基的配制方法，而专利技术人在实际操作中发现，按照常规的溶液配制方法配置得到的富集培养基呈现浑浊状态，完全不能用于Akkermansiamuciniphila的筛选；再次，上述分离方法所使用的富集培养基在配方上以NaHCO3为缓冲溶液，而NaHCO3在高温高压灭菌的过程中不稳定，极易使得培养基呈碱性，与培养基中金属阳离子如Ca2+、Mg2+发生沉淀，形成混浊液；最后，上述分离方法使用的NobleAgar价格昂贵，不适用于大批量的分离筛选；并且，为了达到深层厌氧培养的目的，上述分离方法使用分离培养基进行分离培养时，使用的是倾注法，倾注法会使得在固体培养基内部生长的菌落小，且没有典型的菌落形态，对于后期筛选来说十分不方便，并不适用于菌种的筛选分离培养。综上，应用已发表的方法进行Akkermansiamuciniphila分离中国人群的粪便样本时，Akkermansiamuciniphila的阳性率为0。因此，如何进行Akkermansiamuciniphila筛选培养基(尤其在成分、配制方法两方面)以及Akkermansiamuciniphila筛选方法的优化是亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用。此阿克曼氏菌特异性筛选培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；利用此艾克曼菌特异性筛选培养基对粪便进行阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)的筛选，可使阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)的阳性率高达70％。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，所述培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤。在本专利技术的一种实施方式中，所述黏蛋白在富集培养基中的添加量为0.25～2.5g/L；所述黏蛋白在分离培养基中的添加量为0.25～2.5g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述黏蛋白是经过乙醇洗涤纯化的；所述黏蛋白经乙醇洗涤的次数为2次。在本专利技术的一种实施方式中，所述黏蛋白的纯化方法为取黏蛋白溶解于缓冲液A中，调节pH至7.8，于25～35℃搅拌1h，得到混合液A；将混合液A调节pH至7.0～7.4，于25～35℃搅拌21h，得到混合液B；将混合液B离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液A；在上清液A中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液A与乙醇的混合液中乙醇的终浓度达60％，得到混合液C；将混合液C于4℃静置2h，去上清，得到沉淀A；将沉淀A用NaCl溶液溶解，得到混合液D；将混合液D离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液B；在上清液B中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液B与乙醇的混合液中乙醇的终浓度达60％，得到混合液E；将混合液E于4℃静置2h，去上清，得到沉淀B；将沉淀B用预冷至0～2℃的无水乙醇洗涤后用水重新溶解，得到纯化后的黏蛋白；所述缓冲液A的成分包含KH2PO4、Na2HPO4、NaCl以及吐温80。在本专利技术的一种实施方式中，所述黏蛋白的纯化方法为取黏蛋白溶解于缓冲液A中，调节pH至7.8，于25～35℃搅拌1h，得到混合液A；将混合液A用浓度为2mol/L的HCl溶液调节pH至7.0～7.4，于25～35℃搅拌21h，得到混合液B；将混合液B在10000g的条件下离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液A；在上清液A中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液A与乙醇的混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤，或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤。

【技术特征摘要】
1.一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤，或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤。2.如权利要求1所述的一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述黏蛋白在富集培养基中的添加量为0.25～2.5g/L；所述黏蛋白在分离培养基中的添加量为0.25～2.5g/L。3.如权利要求1或2所述的一种艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述黏蛋白是经过乙醇洗涤纯化的；所述黏蛋白经乙醇洗涤的次数为2次。4.如权利要求1-3任一所述的一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述富集培养基的成分包含黏蛋白以及Na2HPO4。5.如权利要求1-4任一所述的一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述分离培养基的成分包含脑心浸出液肉汤；或所述分离培养基的成分包含脑心浸出液肉汤以及L-半胱氨酸盐酸盐；或所述分离培养基的成分包含脑心浸出液肉汤、L-半胱氨酸盐酸盐以及琼脂；或所述分离培养基的成分包含黏蛋白、脑心浸出液肉汤、L-半胱氨酸盐酸盐以及琼脂。6.如权利要求1-5任一所述的一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，其特征在于，所述初筛培养基的成分包含脑心浸出液肉汤；或所述初筛培养基的成分包含脑心浸出液肉汤以及L-半胱氨酸盐酸盐。7.权利要求1-6任一所述的一种阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基的制备方法，其特征在于，所述富集培养基的制备方法为将水与A液、B液、C液、D液、Na2HPO4以及L-半胱氨酸盐酸盐混合，得到混合液；在混合液中加入黏蛋白溶液，离心取上清，得到富集培养基；所述A液(无机盐溶液)的成分包含NH4Cl、NaCl、CaCl2·2H2O以及MgCl2·6H2O；所述B液(酸性微量元素液)的成分包含FeCl2·4H2O、H3BO3、ZnCl2、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O以及盐酸溶液；所述C液(碱性微量元素液)的成分包含Na2SeO3·5H2O、Na2WO4·2H2O、Na2MoO4·2H2O以及NaOH；所述D液(刃天青储备液)的成分包含C12H6NNaO4。...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟齐啸，陈卫，冯赛赛，田丰伟，陆文伟，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32