一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法技术

本发明专利技术公开了一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法。本发明专利技术首先通过在开始时添加乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，确定进行驯化的浓度范围，之后选择适宜的抑制剂浓度对藻种进行多次驯化和传代，对藻种的生物量和产油能力进行测定，对藻种的遗传稳定性进行评估，选育出了产油能力高的盐生杜氏藻种。

A domestication method for improving oil production capacity of Dunaliella halophyta

The invention discloses a domestication method for improving oil production capacity of Dunaliella halophyta. The method first determines the domestication concentration range by adding acetyl coenzyme A carboxylase inhibitor at the beginning, then chooses the appropriate inhibitor concentration to domesticate and pass on the algae species for many times, determines the biomass and oil-producing ability of the algae species, evaluates the genetic stability of the algae species, and breeds the halophytic Dunaliella species with high oil-producing ability.

【技术实现步骤摘要】
一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法。
技术介绍
近年来，由于全球化石燃料短缺，原油价格过度上涨以及温室气体增加，生物柴油的生产受到了更多关注，其中，微藻作为生产第三代生物燃料的潜在来源而得到广泛关注。正常条件下，大部分的微藻含油量在15％到50％间；在特定的培养条件下，或是利用特殊方式筛选出的部分微藻，含油量可以高达干重的80％。盐生杜氏藻的脂肪酸组成与植物油相似，因此有可能成为生产生物柴油原料的替代品，在生物柴油的生产中具有很大的优势和潜力。其中，盐生杜氏藻的培养基盐度高，培养过程不易染杂菌，经胁迫后油脂积累量最高可达33.4％，由微藻制备的生物柴油，其属性如密度、酸价、过氧化值和水分含量等，均符合国标规定，且微藻生物柴油比0#柴油具有更高的碳氢比，更适合作为燃料使用。乙酰辅酶A羧化酶是藻类脂肪酸合成过程的关键酶，乙酰辅酶A羧化酶抑制剂指抑制该酶活性的一类酶，其中以稀禾啶(sethoxydim，2-[1-(乙氧基亚氨基)丁基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮)为代表的抑制剂能够抑制乙酰辅酶A羧化酶的活性，影响脂质合成反应的限速步骤，从而限制合成该酶能力低的藻，筛选合成脂质能力高的藻种。已有研究表明，通过在含有一定浓度的稀禾啶的培养基里培养海藻，能够有效抑制产油不高的海藻生长，从而筛选得到高产油海藻。在裂殖壶菌中，使用稀禾啶进行驯化，能够提高裂殖壶菌发酵生物量、油脂产量和DHA产量。CN106754862A公开的技术方案中中提出一种高生长能力隐甲藻突变藻株的选育方法，利用诱变和稀禾啶筛选获得了高产油脂的隐甲藻藻种。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法。本专利技术的技术方案如下：一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法，使用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂对盐生杜氏菌进行驯化，具体包括如下步骤：(1)将盐生杜氏藻接种于f/2液体培养基，同时添加不同浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，同时以未添加乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基的培养过程作为对照，确定适合驯化的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的适宜浓度；(2)将盐生杜氏藻接种至含有上述适宜浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，在正常条件下进行驯化培养，获得驯化培养液；(3)按照一定的周期对驯化培养液进行传代，使用含有上述适宜浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基作为传代培养基；(4)当传代至一定次数后，将所得藻种接种至不含乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，培养至藻液OD690达到1.0时，测定其中藻体生物量和油脂含量，并分析油脂组成，获得驯化藻种；(5)将所得驯化藻种继续接种于不含乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，传代一定次数，培养至藻液OD690达到1.0时，测定培养液中藻体生物量和油脂含量，并分析油脂组成，以验证所得驯化菌株的遗传稳定性；上述培养均为光照培养。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂为稀禾啶。进一步优选的，所述步骤(1)中，不同浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的浓度为150～700μmol/L。进一步优选的，所述适宜浓度为400～430μmol/L。进一步优选的，所述传代的周期为1～5d，并使用处于对数生长期，OD690为0.1～0.5的藻液作为种子液，按照5～20％的接种量进行传代。进一步优选的，所述光照培养的温度为22～28℃，光照强度5000～100001x，光暗比12h∶12h，培养过程不充气，每日随机调换摇瓶位置并摇动2～3次。本专利技术的有益效果是：本专利技术首先通过在开始时添加乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，确定进行驯化的浓度范围，之后选择适宜的抑制剂浓度对藻种进行多次驯化和传代，对藻种的生物量和产油能力进行测定，对藻种的遗传稳定性进行评估，选育出了产油能力高的盐生杜氏藻种。附图说明图1为不同浓度稀禾啶对盐生杜氏藻的抑制效果图。图2为不同浓度稀禾啶对盐生杜氏藻生长的影响曲线图。图3为稀禾啶驯化对盐生杜氏藻产油能力的影响曲线图。图4为稀禾啶驯化对盐生杜氏藻形态的影响的显微照片，其中a，b：取自稀禾啶驯化后的藻液；c，d：空白对照组。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。下述实施例中，实验菌种为盐生杜氏藻GY-H13Dunaliellasalina，f/2液体培养基的配方如下表所示：盐生杜氏藻f/2基础培养基配方合成海水配方stocksperliterNaCl24gMgCl2·6H2O1gNa2SO44gCaCl2·6H2O2gKCl0.7gKBr0.1gH3BO30.03gNaSiO3·9H2O0.005gSrCl2·6H2O0.04gNaF0.003gNH4NO30.002gFe3PO4·4H2O0.001g下述实施例中的培养均为光照培养，光照培养的温度为22～28℃，光照强度5000～100001x，光暗比12h∶12h，培养过程不充气，每日随机调换摇瓶位置并摇动2～3次。传代的周期为1～5d，并使用处于对数生长期，OD690为0.1～0.5的藻液作为种子液，按照5～20％的接种量进行传代。实施例1稀禾啶适宜浓度的确定分别配制稀禾啶浓度为343、420、496、573μmol/L的f/2液体培养基，将处于对数生长期的藻液(吸光度约为0.4)按10％接种量，接种到100mL的培养基中，设置两个平行样。每天摇动三角瓶，观察藻体生长情况。在接种后的第三天，藻体生长情况如图1所示，从左至右分别为稀禾啶浓度为0、343、420、496、573μmol/L的培养液，可明显看出，未添加烯禾啶的藻正常生长，稀禾啶浓度为343和420μmol/L的藻液有部分藻存活，但生长情况明显不如空白对照组，稀禾啶浓度为496、573μmol/L的藻液藻体发白，藻大量死亡。藻体生物量用吸光度表示的变化趋势如图2。选用稀禾啶浓度为420μmol/L，驯化天数为3天，控制初始OD690为0.4，并在驯化三天后将存活藻体转移至不含稀禾啶的新鲜培养基进行扩大培养，待OD690达到1.0后，测定此时培养液油脂含量，并在不含稀禾啶的f/2液体培养基中传代5次，测定培养液油脂含量，以检查藻种稳定性。结果如图3，第一次驯化后藻细胞中油脂含量为24.59％，是对照组的143.9％；实施例2本实施例驯化部分与实施例1基本相同，为使用实施例1中第一次驯化所得的藻种进行的第二次驯化。结果如图3，第二次驯化后油脂含量为29.51％，是对照组的192.76％，相比于第一次驯化后的含量增加了20.0％，驯化后藻体的最终生物量与对照组差别不大。将经过两次稀禾啶驯化的藻液和未添加稀禾啶的空白对照组的藻液在生长至第七天时各取样置于显微镜下观察，如图4所示。在相同实验条件和观察条件下，驯化后的藻细胞中可较清晰地观察到被油脂包裹的颗粒，而对照组藻细胞的油脂粒的界面模糊。驯化前后的油脂组成如表1，盐藻中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量极少，通过驯化可以提高其产量，并使棕榈酸的含量大幅提升。表1驯化组与对照组油脂组成对比通过稀禾啶的驯化，可以有效提高盐藻的含油量，分析认为这是由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法，其特征在于：使用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂对盐生杜氏菌进行驯化，具体包括如下步骤：(1)将盐生杜氏藻接种于f/2液体培养基，同时添加不同浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，同时以未添加乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基的培养过程作为对照，确定适合驯化的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的适宜浓度；(2)将盐生杜氏藻接种至含有上述适宜浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，在正常条件下进行驯化培养，获得驯化培养液；(3)按照一定的周期对驯化培养液进行传代，使用含有上述适宜浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基作为传代培养基；(4)当传代至一定次数后，将所得藻种接种至不含乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，培养至藻液OD690达到1.0时，测定其中藻体生物量和油脂含量，并分析油脂组成，获得驯化藻种；(5)将所得驯化藻种继续接种于不含乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，传代一定次数，培养至藻液OD690达到1.0时，测定培养液中藻体生物量和油脂含量，并分析油脂组成，以验证所得驯化菌株的遗传稳定性；上述培养均为光照培养。

【技术特征摘要】
1.一种提高盐生杜氏藻产油能力的驯化方法，其特征在于：使用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂对盐生杜氏菌进行驯化，具体包括如下步骤：(1)将盐生杜氏藻接种于f/2液体培养基，同时添加不同浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，同时以未添加乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基的培养过程作为对照，确定适合驯化的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的适宜浓度；(2)将盐生杜氏藻接种至含有上述适宜浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，在正常条件下进行驯化培养，获得驯化培养液；(3)按照一定的周期对驯化培养液进行传代，使用含有上述适宜浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基作为传代培养基；(4)当传代至一定次数后，将所得藻种接种至不含乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/2液体培养基中，培养至藻液OD690达到1.0时，测定其中藻体生物量和油脂含量，并分析油脂组成，获得驯化藻种；(5)将所得驯化藻种继续接种于不含乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的f/...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌雪萍，段然，卢英华，周芯羽，郭晓昀，陈翠雪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35