一种猪非典型瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种猪非典型瘟病毒APPV抗体检测ELISA试剂盒，以及一种猪非典型瘟病毒蛋白的生产方法，可以高效的表达猪非典型瘟病毒蛋白。本发明专利技术首先提供一种猪非典型瘟病毒蛋白的基因,能在大肠杆菌中高效表达猪非典型瘟病毒蛋白，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；本发明专利技术再一个方面提供一种猪非典型瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，包含有大肠杆菌表达的，氨基酸序列为SEQ ID NO:5的猪非典型瘟病毒E2蛋白作为抗原包被的ELISA板。本发明专利技术提供了大量制备猪非典型瘟病毒E2蛋白的方法，并提供了以猪非典型瘟病毒E2蛋白为抗原的ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒具有较高的灵敏性、特异性、重复性，可以大规模推广应用。

An ELISA Antibody Kit for Detecting SARS Virus in Pigs*

The invention aims to provide a ELISA kit for detecting APPV antibodies of swine atypical virus, and a method for producing a pig's atypical distemper virus protein, which can efficiently express porcine atypical plague virus * * * protein. The invention provides a pig's atypical distemper virus protein gene, which can express the highly pathogenic porcine atypical virus protein in Escherichia coli. The nucleotide sequence of the gene is SEQ ID NO.2. In the second aspect, the invention provides a pig's atypical plague ELISA antibody detection kit, which contains the pig's atypical * * * * virus expressed by E. coli, which is SEQ ID NO:5. The protein acts as an ELISA plate coated with antigen. The * * provides a large number of methods for preparing E2 protein of swine atypical distemper virus, and provides ELISA antibody detection kit with E2 antigen of pig atypical distemper virus. The kit has high sensitivity, specificity and repeatability, and can be widely applied.

【技术实现步骤摘要】
一种猪非典型瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒
本专利技术属于疫苗检测
，具体涉及一种猪非典型瘟病毒(APPV)抗体检测ELISA试剂盒。
技术介绍
猪非典型瘟病毒(APPV)是一种变异性极强的RNA病毒，可引起仔猪先天性震颤，即临床上俗称的“抖抖病”，多见于第一胎母猪所产仔猪，以双侧骨骼肌阵挛性收缩为特征，症状严重时可导致猪行走、吃奶困难，常因初乳摄入不足和饥饿而死亡。该病毒可诱发多种病毒、细菌的混合感染和继发感染，给全球养猪业造成巨大的经济损失。对此病的研究，特别是对其疫苗的研究正日益受到关注。随着我国养猪业的发展，头胎母猪新生仔猪受到猪非典型瘟病毒感染的危害日益严重，因此研发一种快速、准确的APPV血清抗体检测方法的需求愈发迫切。目前，临床上对于APPV的检测，目前主要是通过流行病学、临床症状和病理剖检变化做出初步诊断，但APPV与CSFV等通过简单的临床检查、病理剖检等手段难以确诊。因此，该病的确诊还需要附以实验室诊断。然而实验室诊断例如间接免疫荧光、聚合酶链式反应、病毒分离培养等方法，存在检测耗时长、费用高、过程复杂、需要特定的仪器设备，规模化推广难度较高。因此，研发操作简单、敏感性高、特异性强的检测试剂盒是检测APPV的必要手段。APPVE2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白,是猪瘟病毒毒力及宿主范围的主要决定性因素,位于病毒粒子外表面,有跨膜区,是建立猪瘟病毒血清学检测方法的主要抗原。因此,猪瘟病毒E2蛋白是开发猪瘟病毒新型疫苗及诊断试剂的重要蛋白分子。为了更广泛的利用猪非典型瘟病毒蛋白，研究者将猪非典型瘟病毒E2蛋白基因克隆到大肠杆菌中进行表达。但猪非典型瘟病毒E2蛋白在原核细胞中表达效率很低，使E2蛋白作为检测抗原应用范围受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪非典型瘟病毒(APPV)抗体检测ELISA试剂盒，以及一种猪非典型瘟病毒蛋白的生产方法，可以高效的表达猪非典型瘟病毒蛋白，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种猪非典型瘟病毒蛋白的基因,能在大肠杆菌中高效表达猪非典型瘟病毒蛋白，该基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2；AATGGTAGTTATAACATAGTGAGGCAGGCCAGAGACGAAGTAAGCCCGTCGACAGGGTGTAAAGAAGGATATCCCTTCCTGTTTTCTGGAGAAAGATCCGACACCTCATGTCTAAAGCCTCCATCCACTAGTTGGGTCCGTCCAGTAAAAATGGATGAGGTATCTGTGGCAGATAGCTTCGCCCATGGTGTAGACAAGGCGATCATCCTGATTCGTAAAGGTGCGTCTGGTATCATCAACTTTCTGGACACCATTGGTCGTTGGCTGCCAGTGGCTGAAGCCGCCATCGTACCATATTGTGAAACTTATACTGTAACCGGTATGTACGTTCATGTGAAGCATTGCCTGCCGAAGGGTCTGCCAAAGCATTCTAAAATCATTTCCCCAACCATGATCTACCTGGGTGAAGGTGACCCAGCCCATAACATCCAGCATCTGTTTGGCTCTGGCATCGCAAAGTGGGTTCTGGTTCTGCTGGGTGTTCTGGGTGAGTGGTATGGTGAGCTGGCCTCCACCATCTATCTGCTGCTGGAGTACGGTACTGAATGGCTGGAACATGAATCTCTGGTTACCGAAGGTCTGATCCCGGGCATCAACATCACCGTAGAGCTGCCGGCTTCTCACACCGTACCAGGTTGGGTGTGGGTTGCTGGCCAGTGGATCTGCGTGAAGCCAGATTGGTGGCCGACCCAGATTTGGATTGAAACCATCGTGACCGAGGTATGGCATATCCTGAAAATCCTGGCATCTGCTCTGGTAAACATCGTTACTGCATTCGTAAACCTCGAGCTGGTGTACCTGGTTATCATCCTGGTTAAAATCTCTAAGGGTAACCTGATCGGTGCTGTACTGTGGTGCCTGCTGCTGTCTGGTGCTGAGGGTTCTTGCCACCGTCGTCAAGACTATTACAACATCCAACTGGTTGTTGAGGAAAAAACCGGTATCGAGAAGCGTTCTATCATTGGCAAGTGGACTGTGATCACTCGTGAAGGCCGTGAACCACGTCTGATGGAGCAGATCAACATGGTGTCTAACGAGACCCTGTCTGAAACTTACTGC用于扩增上述突变后基因的扩增引物，其序列信息如下：上游引物F1：5’-CGGATCCCGTCCAGTAAAAATGGATG-3’(BamHI)(SEQIDNO.3)；下游引物R1：5’-CGGAATTCGCAGTAAGTTTCAGACAGGG-3’(EcoRI)(SEQIDNO.4)。本专利技术再一个方面提供一种猪非典型瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，包含有大肠杆菌表达的，氨基酸序列为SEQIDNO:5的猪非典型瘟病毒(APPV)E2蛋白作为抗原包被的ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标记结合物、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液；其中阳性对照血清，是用APPV疫苗接种健康猪制成的；阴性对照血清为健康猪的血清；所述的样品稀释液为用0.01MpH7.2的PBS溶液稀释的大肠埃希氏杆菌BL21(E.coliBL21)的菌体超声后的上清溶液，其蛋白浓度为1.2mg/ml；所述的酶标记结合物是辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体用酶标抗体稀释液稀释12000倍制成的(例：取10μl酶标抗体，加酶标抗体稀释液120ml)。所述的洗涤液，是将14.9gKH2PO4，79.1gK2HPO4·3H2O，50.0mlTritonx-100，1.0gNaN3，8.0gNaCl溶于500ml水中，调pH7.3，最终定容至1L。所述的底物溶液A，是将4.2g柠檬酸，13.6g醋酸钠，0.5g过氧过脲溶解在100ml去离子水中，定容至1L，调pH值到5.0制成的；底物溶液B，是将1gTMB溶解于50ml二甲基亚砜中，溶解后再加入100ml甲醛，16.0g聚乙烯吡咯烷酮，溶解后用去离子水定容至1L完成制备。所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。本专利技术所使用的猪非典型瘟病毒(APPV)E2蛋白，其制备方法如下：将核苷酸序列为SEQIDNO.2的E2蛋白编码基因整合到pET28a载体上构建成重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞进行诱导表达，通过His镍柱分离纯化带有His标签的E2蛋白，其中ELISA板的制备方法，是将纯化的猪非典型瘟病毒(APPV)E2蛋白抗原用pH9.5、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至25μg/ml，加入96孔包被板中，100μl/孔，置4℃过夜，用洗涤液洗涤3次后，加入含1％BSA0.01mol/LpH7.2PBS封闭过夜，甩去封闭液，置于室温、湿度40％之下，自然干燥24-48小时完成制备。本专利技术提供了大量制备猪非典型瘟病毒(APPV)E2蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪非典型瘟病毒蛋白的基因,其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种猪非典型瘟病毒蛋白的基因,其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2。2.一种用于扩增权利要求1所述的基因的扩增引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物的序列为SEQIDNO.3；下游引物的序列为SEQIDNO.4。3.一种猪非典型瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有氨基酸序列为SEQIDNO:1的猪非典型瘟病毒E2蛋白作为抗原包被的ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标记结合物、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液；其中阳性对照血清，是用APPV疫苗接种健康猪制成的；阴性对照血清为健康猪的血清；所述的E2蛋白，将核苷酸序列为SEQIDNO.2的E2蛋白编码基因整合到pET28a载体上构建成重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞进行诱导表达，通过His镍柱分离纯化制备的。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液为用0.01MpH7.2的PBS溶液稀释的大肠埃希氏杆菌BL21的菌体超声后的上清溶液。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标记结合物是辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体用酶标抗体稀释液稀释12000倍制成的。6.如权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐保娟，崔晓霞，孙厚民，王丽萍，宫晓，郭伟伟，李陆梅，郝尧光，王宗升，韩乃君，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37