一种使精原干细胞高效向神经细胞分化的培养体系和方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，涉及精原干细胞(SSCs)向神经细胞分化的体外高效培养方法。本发明专利技术通过多聚赖氨酸处理培养器皿，增加SSCs贴壁能力，添加神经因子B27和N2，以及去除生长因子条件下，结果显示SSCs可高效向神经细胞分化。本发明专利技术建立的方法适合流程化操作、重复性高、成功率高、操作简单，无需特殊化条件就能达到效果，可极大的节省时间和试验材料，以往多应用多能干细胞进行神经细胞诱导，存在诱导的不彻底性。本发明专利技术应用SSCs，对比胚胎干细胞(ESCs)显示出SSCs向神经细胞分化高效性和彻底性，本研究结果显示SSCs诱导效果明显具有优势。可能成为应用到修复神经组织损伤的一种更优化的干细胞来源，成为一个新的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
一种使精原干细胞高效向神经细胞分化的培养体系和方法
本专利技术属于细胞生物学研究
，涉及精原干细胞向神经细胞分化的方法，可应用于神经细胞分化及神经组织损伤修复在临床医学应用方面的研究。
技术介绍
目前只有啮齿动物精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSCs)获得了体外长期培养，人和其他物种干细胞仍不能长期培养，所以小鼠SSCs成为通用的细胞模型使用。精原干细胞和神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)存在着紧密的联系，具有很多相似的干细胞特征。首先，胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)是SSCs维持自我更新最关键的信号因子，而NSCs维持体外增殖的重要因子是脑源神经营养因子(BDNF)；其次，研究还发现基质源细胞因子(CXCL12)在SSCs和NSCs自我更新调控中都发挥着重要作用；再次，表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)也能促进两类干细胞增殖；此外，神经细胞添加剂(B27)和N2对于NSCs增殖和分化调控具有重要的作用，随后在体外培养SSCs中也通常添加两类添加剂，这对于SSCs体外维持自我更新也具有重要促进作用。两类干细胞展现出诸多相似的生物学特征，显示SSCs有可能是神经细胞分化的一种更好的细胞来源，但先前多使用多功能干细胞和间充质干细胞诱导神经细胞分化，作为神经修复的细胞来源。NSCs具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，是神经系统疾病治疗的潜在细胞。但是NSCs分化的调控机制研究还并不透彻。以往研究显示诱导多能干细胞向神经细胞分化，需要添加神经因子B27和N2两种试剂进行诱导，但存在诱导分化效率低和不彻底性等问题；在中，体外促进小鼠SSCs增殖的培养体系中，会添加B27和N2两种试剂，对于小鼠SSCs增殖有重要的促进的作用；由此看出，SSCs体外培养体系和神经细胞诱导的体系非常接近，SSCs有可能成为替代NSCs较为理想的成体干细胞。但以往的研究并没有建立高效诱导精原细胞向神经分化的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种培养体系，该培养体系可以使精原干细胞(SSCs)高效向神经细胞分化。本专利技术还提供了精原干细胞(SSCs)高效向神经细胞分化的方法。本专利技术的目的通过以下技术手段实现：一方面，本专利技术提供了一种使SSCs向神经细胞分化的培养体系，该培养体系无饲养层，无生长因子，且含有L-谷氨酰胺、神经因子B27和N2。本专利技术首次发现了，SSCs在特定的培养体系中，可分化为神经细胞，这个技术可能应用到临床中去解决一些神经性疾病的难题，SSCs有可能成为神经性疾病治疗的新的种子细胞。在现有技术中，SSCs的培养，一般是建立在有饲养层的基础上促进其体外增殖。但本专利技术研究发现无饲养层条件下可以更好的促进SSCs向神经分化，在存在饲养层条件下，未发现SSCs向神经细胞分化。此外，现有的SSCs培养体系，一般含有生长因子，以促进SSCs增殖，而对于本专利技术来说，生长因子的存在会影响SSCs向神经细胞分化，因此，无生长因子也是必须的。进一步地，在所述的培养体系中，L-谷氨酰胺、B27和N2的在体系中的体积分数分别为0.8～1.2％、1～3％、0.8～1.2％。作为优选的实施实施方式，L-谷氨酰胺、B27和N2的在体系中的体积分数分别为1％、2％、1％。作为优选的实施方式，本专利技术的培养体系中，含有以下组分：作为更优选的实施方式，所述的培养体系中，含有以下组分：本专利技术中，所述的B27是一种神经类细胞的营养混合物，含有20多种物质，对NSCs和SSCs有促进增殖的作用。所述的N2为腐胺，黄体酮，转铁蛋白，胰岛素和亚硒酸盐的混合物。所述的Stro-34培养基为造血干细胞专用培养基，可支持SSCs体外增殖。上述的物质均可以商业购买，其成分确定的。另一方面，本专利技术还提供了一种使精原干细胞向神经细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：包含以下步骤：(1)采用多聚赖氨酸处理培养器皿；(2)接种精原干细胞(SSCs)；(3)培养。具体地，步骤(1)中，采用多聚赖氨酸处理培养皿：配置0.01～0.05％的多聚赖氨酸加入到培养器皿，要求没过培养器皿，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体，PBS磷酸缓冲液液轻轻洗涤2-3次，放入培养箱，待接入细胞。步骤(2)中，接种精原干细胞：将培养好的精原干细胞单细胞悬液，细胞密度为0.8～1.2×105个/mL，接入到处理好的培养器皿。步骤(3)中，应用上述配制的神经诱导培养基进行细胞培养，培养条件是5％CO2和37±1℃，22～26h后采用半量换液，继续培养5～7天，即可以获得生殖干细胞分化的神经细胞。作为优选的实施方式，步骤(1)中，采用0.01％的多聚赖氨酸处理培养器皿。作为优选的实施方式，本专利技术中的培养体系和方法，所适用的精原干细胞为小鼠精原干细胞，当然，其也可以适用于其他的物种的精原干细胞，(如人和猪精原干细胞)精原干细胞是一类保守的干细胞，根据以往研究发现，不同物种之间精原干细胞基因表达和生物学性质上无本质差别，故本方法也可以适用于其他物种精原干细胞诱导神经分化的研究应用，特别可以尝试应用到人类的精原干细胞中，这样可以为神经损伤病人提供另一种高效干细胞修复方案。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的专利技术人发现在存在饲养层条件下，未发现SSCs向神经细胞分化，诱导神经细胞分化体系，结合SSCs和NSCs生物学性质，通过实验探索和不断改进方案，最终建立起一种诱导小鼠SSCs高效向神经细胞分化的无饲养层培养的培养液，该培养液只是在SSCs培养体系基础上去除了生长因子，多添加了N2试剂(该试剂在该培养液中主要的作用是促进向神经细胞分化)；在这个培养液下小鼠SSCs高效快速和彻底地向神经细胞分化，这说明SSCs可能是替代NSCs的神经细胞更好的修复替代细胞；2、本专利技术建立的诱导小鼠SSCs向神经细胞分化的方法，需要时间短，大约一周时间就可以出现典型神经元细胞和胶质细胞，本专利技术方法适合流程化操作、重复性高、成功率高、操作简单，无需特殊化条件就能达到效果，可极大的节省时间和试验材料，对比以往建立干细胞诱导神经细胞的方法具有明显优势；3、本专利技术的方法在神经细胞分化与获得，以及神经系统疾病修复等方面具有潜在应用价值，本专利技术方法可以应用到临床中去解决一些神经性疾病的难题，SSCs有可能成为神经性疾病治疗的新的种子细胞。附图说明图1为小鼠SSCs向神经细胞分化的结果技术路线图。图2为小鼠SSCs向神经细胞分化过程；其中，A：无饲养层培养的小鼠SSCs；B，C和D：小鼠SSCs向神经细胞诱导第3，4和5d；E：诱导神经细胞第6d，出现了神经突触；F和G：诱导第6d和7d，出现大量典型神经细胞和神经元；H：饲养层培养下小鼠SSCs诱导未出现明显分化，无神经细胞产生。图3为小鼠ESCs(小鼠胚胎干细胞)向神经分化诱导过程；其中A：新接种ESCs；B、C、D、E和F：分别为诱导神经分化第2、3、4、5和6天；G：NESTIN免疫荧光染色；H：无诱导的ESCs。在这个培养过程中，ESCs出现了神经分化，但各个时期仍存在ESCs残留，分化不完全，总体效率低于SSCs。图4为小鼠SSCs蛋白检测及分化过程分析；其中，A，B和C：出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使精原干细胞向神经细胞分化的培养体系，其特征在于，所述的培养体系无饲养层，无生长因子，且含有L‑谷氨酰胺、B27、以及N2。

【技术特征摘要】
1.一种使精原干细胞向神经细胞分化的培养体系，其特征在于，所述的培养体系无饲养层，无生长因子，且含有L-谷氨酰胺、B27、以及N2。2.根据权利要求1所述的培养体系，N2在该体系中的体积百分比为0.8～1.2％。3.根据权利要求2所述的培养体系，N2在该体系中的体积百分比为1％。4.根据权利要求1所述的培养体系，B27在该体系中的体积百分比为1～3％。5.根据权利要求4所述的培养体系，B27在该体系中的体积百分比为2％。6.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，含有以下的组分：7.据权利要求6所述的培养体系，其特征在于，含有以下的组分：8.一种使精原干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)采用多聚赖氨酸处理培养皿：配置质量分数0.01...

【专利技术属性】
技术研发人员：白银山，朱翠，刘珊珊，冯美莹，詹小舒，王丙云，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44