一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针的设计、合成及应用制造技术

本发明专利技术涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种多多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测H2O2和H2S方面的应用。该探针化合物的结构式如式(I)所示。我们将两种识别基团通过染料的桥连构建到一个分子上，比率型荧光信号通过两个荧光信号的比值作为输出信号，探针分子本身的自校准能够克服诸如探针浓度、仪器灵敏度和环境因素带来的影响，提高荧光检测的准确性。通过探针与H2S和H2O2反应后获得不同组合的荧光信号来实现对H2S和H2O2的区分检测。此外该系列化合物有望在生物医药，光电以及环境保护领域有着较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针的设计、合成及应用
本专利技术涉及的是化学分析检测
，具体涉及一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测H2O2和H2S方面的应用。
技术介绍
H2O2是其他活性氧的前体分子，在宿主防御，免疫应答和细胞信号传导中起着重要的作用。作为氧化应激的标志物，越来越多的研究表明，体内H2O2浓度的增加会诱导细胞蛋白的氧化损伤，导致神经退行性疾病，心血管疾病，癌症和阿尔兹海默症等。H2S作为体内的一种信号传递分子，在神经调节，细胞凋亡，抗炎症，抗氧化和抑制胰岛素信号传导等生理过程中起着广泛而重要的作用。研究发现，H2S通过提高细胞内谷胱甘肽的水平、调节抗氧化蛋白的高表达等途径，来保护细胞免受氧化应激的损伤。H2S本身具有的还原性也会直接清除H2O2等活性氧物质。H2S和H2O2在生理过程中有如此重要的作用，同时彼此互相影响，开发一种有效的检测方法是至关重要的，特别是对细胞内H2S和H2O2的浓度的监测，对生物学研究和临床诊断至关重要。目前对H2S和H2O2的检测方法主要有比色法、电化学分析法、气相色谱法、滴定法、分光光度法和荧光法等。在这些方法中，荧光探针成像技术由于操作简单，灵敏度高，选择性好，实时成像等优点，特别是对组织的非破坏性而受到特别的关注。近年来开发了大量的荧光探针来检测H2S和H2O2，但他们都是独立的对H2S或H2O2进行选择性检测，还没有一个探针分子可以同时区分检测H2S和H2O2。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种合成路线简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，斯托克斯位移大，发射波长在近红外，能够对体外或者活细胞内进行监测或者细胞成像的荧光探针。比率型荧光信号通过两个荧光信号的比值作为输出信号，探针分子本身的自校准能够克服诸如探针浓度、仪器灵敏度和环境因素带来的影响，提高荧光检测的准确性。通过探针与H2S和H2O2反应后获得不同组合的荧光信号来实现对H2S和H2O2的区分检测。本专利技术解决问题采取的技术方案为，一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针，其分子结构式如下：合成路线如下：具体合成方法如下：将化合物(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基)-1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于丙酮，置于圆底烧瓶中，加入碳酸钾60℃搅拌回流反应。TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，剩余物用柱层析分离纯化，二氯甲烷/乙酸乙酯(v:v＝20:1,含1％三乙胺)作为洗脱剂。干燥得到红色固体本专利技术的荧光探针测试方法如下，将探针分子溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成1.0×10-3mol/L的溶液，室温下进行测试。并且对低浓度的H2S和H2O2可以进行定量检测，具体实施方法在实施实例中详细介绍。本专利技术的荧光探针的作用机理如下，在探针分子中，探针本身发蓝色荧光，且有两个反应位点。当探针与H2S反应时，位点1的叠氮基被还原，随后醚键被切断，经过快速的分子内成环反应得到发蓝色荧光的HCB和发红色荧光的TQC。当探针TCAB与H2O2反应时，位点2的醚键被切断，释放出发蓝绿色荧光的化合物TCA，探针的荧光发生了从蓝光到蓝绿色的比值变化。通过探针TCAB与H2S和H2O2反应得到不同的荧光信号：H2S(蓝光+红光)，H2O2(蓝光→蓝绿光)，可以实现对H2S和H2O2的区分检测。随后，我们进一步研究了探针与两种响应物叠加响应的情况。当向探针TCAB与H2S响应后的溶液中继续加入H2O2时，前一步的产物HCB上的苯硼酸酯会继续被H2O2切断，从而释放出蓝绿色的荧光染料HC，同时之前得到的红光染料TQC不受影响。同样的，向探针TCAB与H2O2响应后的溶液中继续加入H2S时，TCA上的叠氮基会继续被H2S还原，醚键断裂，再经过快速的分子内成环反应得到发蓝绿色荧光的染料HC和发红色荧光的染料TQC。由此可见，探针TCAB可以实现对H2S和H2O2的连续检测。探针分子的响应过程：本专利技术的荧光探针探针TCAB与H2S和H2O2的荧光响应测试在HEPES缓冲液(20mM,1.0mMCTAB,pH＝7.4)中进行。探针本身在413nm处发蓝色荧光。当探针TCAB的溶液中加入H2O2时，413nm处的荧光下降，同时在486nm处有新的蓝绿色荧光生成(激发波长为325nm)。荧光滴定实验结果显示，随着H2O2浓度的增大，486nm处的荧光强度(F486nm)与413nm处的荧光强度(F413nm)的比值显著增大，当H2O2浓度达到400μM时，F486nm/F413nm的值达到最大。并且F486nm/F413nm的值与H2O2的浓度在20-100μM范围内有很好的线性关系，线性相关系数为0.9968。另外，当探针TCAB与H2S响应时，反应液在413nm处的蓝色荧光增强(激发波长为325nm)，同时在627nm处有新的红色荧光生成(激发波长为475nm)。随着H2S浓度的增加，反应体系在413nm和627nm处的荧光强度逐渐增强，在350μM的H2S加入时，荧光强度达到最大值。并且探针TCAB在413nm和627nm处的荧光强度与H2S在浓度范围为0-150μM时具有很好的线性关系，线性相关系数分别为0.9905和0.9901。根据信噪比S/N＝3，计算出探针TCAB对H2S和H2O2的检测限分别为0.058和0.044μM。随后，我们还测定了探针TCAB与H2S和H2O2响应前后的紫外光谱变化情况本专利技术所述的探针分子合成路线简单，成本较低，对H2S和H2O2的选择性好、抗干扰能力强，斯托克位移大，该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。附图说明图1为本专利技术荧光探针TCAB(10.0μM)在HEPES缓冲液(20mM,1.0mMCTAB,pH＝7.4)中与H2O2(400μM)和H2S(350μM)响应前后的紫外吸收光谱。图2(A-B)探针TCAB(10.0μM)与H2O2完全反应后的溶液随H2S浓度增加的荧光光谱变化。(C-D)探针TCAB(10.0μM)与H2S完全反应后的溶液随H2O2浓度增加的荧光光谱变化。激发波长：第一列325nm；第二列475nm。激发和发射狭缝宽度为5nm/5nm。图3为本专利技术的荧光探针TCAB(10.0μM)在HEPES缓冲液(20mM,1.0mMCTAB,pH＝7.4)中与H2O2(400μM)和H2S(350μM)响应时，F486nm/F413nm的比值以及413nm和627nm处的荧光强度随时间的变化。激发波长：(A)325nm,(B)325nm,(C)475nm。图4为本专利技术的荧光探针TCAB(10.0μM)在HEPES缓冲液(20mM,1.0mMCTAB,pH＝7.4)中与相关分析物响应后，F486nm/F413nm的比值以及413nm和627nm处的荧光强度变化。分析物包括：(1)ROO.,(2)NO.,(3)ClO-,(4)O2-,(5)TBHP,(6)TBO.,(7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针，其结构如式(I)所示；

【技术特征摘要】
1.一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针，其结构如式(I)所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋相志，韩金良，杨雷，廖立德，张赟，张帆，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43