一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用。所述纳米粒的制备方法步骤如下：S1.采用高温乙酸法，利用罗非鱼鱼鳃制备抗菌肽粗提液；S2.将浓度为0.2%～0.4%壳聚糖溶液溶于乙酸溶液中，pH调至2～4；S3.将壳聚糖溶液和抗菌肽粗提液按照体积比为2～5：1～3混合，搅拌15～120 min，得到混合溶液；S4.按壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为5～8：1，向步骤S3所得混合溶液中滴加浓度为0.5～3.0 mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌15～120 min，即得抗菌肽壳聚糖纳米粒。本发明专利技术制备的纳米粒包封率高、载药量高、抑菌率高、体外稳定释放效果好，其制备工艺稳定、安全性能高。

A chitosan nanoparticle of antimicrobial peptide from gill of tilapia and its preparation method and Application

The invention discloses a tilapia gill antimicrobial peptide chitosan nanoparticle, a preparation method and application thereof. The preparation steps of the nanoparticles are as follows: S1. Antimicrobial peptide crude extract is prepared from Tilapia gills by high temperature acetic acid method; S2. The concentration of 0.2%-0.4% chitosan solution is dissolved in acetic acid solution with pH adjusted to 2-4; S3. Chitosan solution and antimicrobial peptide crude extract are mixed according to volume ratio of 2-5:1-3 and stirred for 15-120 minutes to obtain a mixed solution; S4. According to chitosan and tri. Antimicrobial peptide chitosan nanoparticles were prepared by mixing sodium tripolyphosphate solution of 0.5-3.0 mg/mL with a mass ratio of 5-8:1 and stirring for 15-120 min. The nanoparticles prepared by the invention have high encapsulation efficiency, high drug loading, high bacteriostasis rate, good stable release effect in vitro, stable preparation process and high safety performance.

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用。
技术介绍
目前抗菌肽的制备可分为直接提取法、化学合成法、基因工程法和酶法等方式。化学合成法可以得到高抑菌活性抗菌肽，但污染环境，化学残留、成本高、合成肽的长度有限，副产物多。基因工程法成本低，可获得大量抗菌肽，但技术尚未成熟，体细胞存在自杀行为。酶法环保、条件容易控制、得率高，但分离效率降低，副产品难以除去。抗菌肽不同于抗生素，可以极大地削减细菌发生耐药性的可能性，但由于肽类或蛋白类质药物在体内半衰期短，严重限定了药效作用的施展。因此，解决抗菌肽在体内外吸收差和不稳定易降解，延长抗菌肽的释放时间，控制抗菌肽平稳释放的问题具有重要的临床意义。近年来，研究发现，纳米粒负载药物具有良好的生物相容性等特点，保护肽药物免受胃肠道的恶劣环境的优点，还能提高药物生物学功能。大部分传统纳米粒在体内会迅速被网状内皮系统吞噬，而作为制备纳米粒材料的壳聚糖克服了传统纳米粒被网状内皮系统吞噬的缺点，延长药物在体内循环的时间，从而达到更好的医治效果。目前壳聚糖纳米粒的常用制备方法有物理方法和化学方法。物理方式因存在诸多缺点很少采用。化学制备方式有很多种，包括离子交联法、共价交联法、大分子复合法、沉淀析出法和自组装法等。共价交联法存在操作复杂、反应条件不易控制、有机溶剂使用多、交联剂对细胞毒性较大的缺点。沉淀析出法工艺简单，但制备过程较复杂，条件较苛刻，不易通过反应条件来调控纳米粒大小。此外，我国每年会有大量的淡水鱼鱼鳃等下脚料产生，这些鱼鳃下脚料富含蛋白质，若没有加工利用，便造成了蛋白质资源的极大浪费甚至是环境的污染。因此，对鱼鳃合理的开发与利用，对于提高加工的综合效益及减少环境污染具有重要的意义。因此，目前需要研究一种以鱼类鱼鳃为原料制备抗菌肽壳聚糖纳米颗粒的新工艺。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有抗菌肽壳聚糖纳米粒制备方法的缺陷和不足，提供一种以罗非鱼鱼鳃为原料制备抗菌肽壳聚糖纳米粒的方法。该方法制备的抗菌肽壳聚糖纳米粒包封率和载药量高，具有较强的抑菌效果，工艺稳定可行，安全性能高。本专利技术的另一个目的是提供上述制备方法制备得到的抗菌肽壳聚糖纳米粒。本专利技术的另一个目的是提供上述抗菌肽壳聚糖纳米粒在制备抗菌药物中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒的制备方法。首先，利用高温乙酸法从罗非鱼鱼鳃粉中提取抗菌肽，配置壳聚糖溶液，调节pH，将壳聚糖溶液加入到抗菌肽溶液，搅拌，再滴加三聚磷酸钠的溶液，搅拌，即得到抗菌肽壳聚糖纳米粒。本专利技术采用高温酸解法从罗非鱼鱼鳃下脚料中提取出抗菌肽，按比例往抗菌肽粗提液中添加壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液，利用离子交联法制备罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒，以载药量、包封率作为优化指标，通过单因素和响应面法优化罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒的制备条件，用Design-Expert8.0.6Trial进行分析，从而筛选出制备罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒的最优选的制备参数，制备出稳定的抗菌肽缓释制剂和新型天然抑菌药物。并测定了所得纳米粒的性能，结果表明，由本专利技术方法制备得到的抗菌肽壳聚糖纳米粒具有包封率高、载药量高、抑菌率高、体外稳定释放效果好的优点。具体地，所述罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒的制备方法，包括如下步骤：S1.采用高温乙酸法，利用罗非鱼鱼鳃制备抗菌肽粗提取液；S2.将浓度为0.2％～0.4％壳聚糖溶液溶于浓度为1％～3％的乙酸溶液中，pH调至2～4；S3.将壳聚糖和抗菌肽粗提取液按照体积比为2～5：1～3混合，搅拌时间为15～120min，得到混合溶液；S4.按壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为5～8：1，向步骤S3所得混合溶液中滴加浓度为0.5～3.0mg/mL的三聚磷酸钠的溶液，于800～2000r/min下搅拌15～120min，即得抗菌肽壳聚糖纳米粒。优选地，步骤S2中所述壳聚糖浓度为0.25％～0.35％。更优选地，步骤S2中所述壳聚糖浓度为0.3％。优选地，步骤S2中所述pH为2.8～3.8。更优选地，步骤S2中所述pH为3.7。优选地，步骤S4中所述壳聚糖：抗菌肽体积比为2～4：1～2。更优选地，步骤S4中所述壳聚糖：抗菌肽体积比为2：1。优选地，步骤S3中所述搅拌时间为30～90min。更优选地，步骤S3中所述搅拌时间为60min。优选地，步骤S4中所述按壳聚糖：三聚磷酸钠质量比为5～6：1。更优选地，步骤S4中所述按壳聚糖：三聚磷酸钠质量比为5：1。优选地，步骤S4中所述三聚磷酸钠浓度为1.5～3.0mg/mL。更优选地，步骤S4中所述三聚磷酸钠浓度为2.10mg/mL。优选地，步骤S4中所述搅拌时间为30～90min。更优选地，步骤S4中所述搅拌时间为30min。优选地，步骤S4中所述搅拌速度为800～1000r/min。更优选地，步骤S4中所述搅拌的速度为800rpm/min。作为一种优选的具体实施方式，所述制备方法具体包括如下步骤：S1.采用高温乙酸法，利用罗非鱼鱼鳃制备抗菌肽粗提取液；S2.将浓度为0.3％壳聚糖溶液溶于乙酸溶液中，pH调至3.7；S3.将壳聚糖和抗菌肽粗提取液按照体积比为2：1混合，将壳聚糖溶液加入抗菌肽粗提取液中，搅拌时间为60min，得到混合溶液；S4.按壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为5：1，向步骤S3所得混合溶液中滴加浓度为2.1mg/mL的三聚磷酸钠的溶液，于800r/min下搅拌30min，即得抗菌肽壳聚糖纳米粒。另外，利用上述制备方法制备得到的抗菌肽壳聚糖纳米粒也在本专利技术保护范围之内。优选地，所述抗菌肽壳聚糖纳米粒中壳聚糖、抗菌肽和三聚磷酸钠的体积比为5：2.5：1，所述抗菌肽壳聚糖纳米粒的粒径为50～200nm。另外，本专利技术制备得到的抗菌肽壳聚糖纳米粒对大肠杆菌和枯草杆菌有较好的抑菌效果，因此，所述抗菌肽壳聚糖纳米粒在制备抗菌药物中的应用也应该在本专利技术保护范围之内。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术制备工艺操作简单，稳定可行，制得的抗菌肽壳聚糖纳米微粒主要成分是罗非鱼鱼鳃中提取的具高效的抑菌特性的抗菌肽，而其他添加的成分均为天然提取物，不受化学试剂的污染，不含有对机体有害的物质，对人体几乎无副作用、安全性能高，包封率高，载药量高，具有较强的双重抑菌效果，体外缓释性能良好且释放时间较长，生产成本低，是一种稳定的抗菌肽缓释制剂和新型天然抑菌药物，可广泛应用于医药、食品、农业、工业、畜牧业等领域。附图说明图1为不同的CS质量浓度对纳米粒包封率、载药量影响。图2为不同TPP浓度对纳米粒包封率、载药量影响。图3为不同的CS/TPP质量比对纳米粒包封率、载药量影响。图4为壳聚糖溶液不同pH值对纳米粒包封率、载药量影响。图5为不同的抗菌肽溶液体积对纳米粒包封率、载药量影响。图6为加入抗菌肽后的不同搅拌时间对形成纳米粒包封率、载药量影响。图7为加入TPP后不同的搅拌时间对形成纳米粒包封率、载药量影响。图8为蛋白质标准曲线图。图9为抗菌肽纳米颗粒对大肠杆菌抑菌效果的检测。图10为抗菌肽纳米粒包封率的测定结果。图11为抗菌肽纳米粒的储存稳定性。图12为抗菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采用高温乙酸法，利用罗非鱼鱼鳃制备抗菌肽粗提液；S2.将浓度为0.2%～0.4%壳聚糖溶液溶于浓度为1%～3%的乙酸溶液中，pH调至2～4；S3.将壳聚糖溶液和抗菌肽粗提液按照体积比为2～5：1～3混合，搅拌时间为15～120 min，得到混合溶液；S4.按壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为5～8：1，向步骤S3所得混合溶液中加入浓度为0.5～3.0 mg/mL的三聚磷酸钠溶液，于800～2000 r/min下搅拌15～120 min，即得抗菌肽壳聚糖纳米粒。

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采用高温乙酸法，利用罗非鱼鱼鳃制备抗菌肽粗提液；S2.将浓度为0.2%～0.4%壳聚糖溶液溶于浓度为1%～3%的乙酸溶液中，pH调至2～4；S3.将壳聚糖溶液和抗菌肽粗提液按照体积比为2～5：1～3混合，搅拌时间为15～120min，得到混合溶液；S4.按壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为5～8：1，向步骤S3所得混合溶液中加入浓度为0.5～3.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液，于800～2000r/min下搅拌15～120min，即得抗菌肽壳聚糖纳米粒。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中所述壳聚糖浓度为0.25%～0.35%。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中所述pH为2.8～3.8。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢冬梅，曾靖雅，
申请(专利权)人：岭南师范学院，
类型：发明
国别省市：广东,44