本发明专利技术公开了一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用，其样品检测反应液中DNA模板为提取的霍乱弧菌基因组DNA，最低检测限为192fg/μL，针对附属毒素蛋白编码基因hlyA、rtxA、tlh，各设计六条特异性引物：FIP、BIP、F3、B3、LF和LF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.18所示，反应恒温为65℃，反应时间为40min，仅通过肉眼观测或在紫外光下观测即可判定检测结果，属于生物检测技术领域，为我国重要食源性致病菌霍乱弧菌的检测及其在食品工业、公共卫生领域的应用提供快速、简单、灵敏、特异的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用
本专利技术属于生物检测
，涉及一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用。
技术介绍
霍乱弧菌(Vibriocholerae)是人烈性肠道传染性疾病霍乱的致病菌。该菌隶属于γ变形菌纲(Proteobacteria)、弧菌目(vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)，革兰氏染色阴性。霍乱弧菌广泛分布于近岸海水、养殖水域，以及鱼类、甲壳类、贝类等水产品中，摄食毒性霍乱弧菌污染的水或水产品会导致严重的呕吐，腹泻，甚至死亡。根据文献报道，自1817年以来，霍乱弧菌引起全球七次霍乱大流行，其中第七次始于1961年一直延续至今，导致数百万人死亡。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)的最新报道，2017年12月霍乱疫情在索马里暴发，截至2018年6月共造成4643例霍乱病例，32人死亡。迄今为止，已发现至少206种血清型霍乱弧菌，其中仅O1和O139血清型菌株产生霍乱毒素(choleratoxin，CT)及其受体毒素共调节纤毛(toxincoregulatedpilus，TCP)，造成霍乱大流行。近年来，大量研究发现，非O1/O139血清型菌株与霍乱局部暴发和临床散发病例相关，其基因组可携带分泌型溶血素A(haemolysinA，HlyA)、毒素中肌纤蛋白交叉连接重复子A(actincross-linkingrepeatsintoxinA，RtxA)、不耐热溶血素(thermolabilehaemolysin，Tlh)等附属毒素蛋白(accessorytoxinproteins)编码基因，因此，检测这些毒力相关基因对于保障国家食品安全、人民健康迫切需要。传统的基因体外扩增聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)受诸多因素限制，如需要两条特异性引物；需要30～35个模板DNA的变性、复性和延伸的反应循环，且分别在三种不同的温度条件(93～95℃、55～65℃、72℃)下进行，需要特殊的PCR仪；需要2～3h才能完成；还需要打开PCR反应管，通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像仪检测反应产物等。近年来基因的体外环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术因其恒温特性，而在生物检测领域备受关注。
技术实现思路
为克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物和LB引物。优选的，所述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因包括溶血素A(hlyA)、毒素中肌纤蛋白交叉连接重复子A(rtxA)、不耐热溶血素(tlh)的编码基因。更优选的，针对所述hlyA基因，所述FIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1；所述BIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.2；所述F3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3；所述B3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.4；所述LF引物的核苷酸序列为SEQIDNo.5；所述LB引物的核苷酸序列为SEQIDNo.6。更优选的，针对所述rtxA基因，所述FIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.7；所述BIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.8；所述F3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.9；所述B3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.10；所述LF引物的核苷酸序列为SEQIDNo.11；所述LB引物的核苷酸序列为SEQIDNo.12。更优选的，针对所述tlh基因，所述FIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.13；所述BIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.14；所述F3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.15；所述B3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.16；所述LF引物的核苷酸序列为SEQIDNo.17；所述LB引物的核苷酸序列为SEQIDNo.18。本专利技术的第二方面，上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备治疗或诊断霍乱疾病药物中的应用。本专利技术的第三方面，上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备核酸扩增试剂中的应用。本专利技术的第四方面，霍乱弧菌检测试剂盒，包括上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，还包括待测样品的霍乱弧菌基因组DNA模板。优选的，所述霍乱弧菌检测试剂盒还包括甜菜碱、反应缓冲液、dNTPs、显色剂、BstDNA聚合酶，以及灭菌去离子水或超纯水。优选的，所述DNA模板的最低检测限为192fg/μL。本专利技术的第五方面，上述霍乱弧菌检测试剂盒在检测霍乱弧菌上的应用。本专利技术的第六方面，霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的霍乱弧菌基因组DNA作为DNA模板；(2)设计霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组；(3)配制待测样品的LAMP检测反应液：包括不同终浓度的步骤(1)中所述模板DNA、步骤(2)中所述检测引物组、甜菜碱、反应缓冲液、dNTPs、显色剂和BstDNA聚合酶的灭菌去离子水或超纯水溶液；(4)运行LAMP扩增反应：在反应温度为65℃下将步骤(3)中所述LAMP检测反应液恒温孵育40min终止反应；(5)LAMP扩增结果鉴定：通过肉眼观察经步骤(4)LAMP扩增反应后的显色情况，判断检测结果。优选的，所述DNA模板的最低检测限为192fg/μL。优选的，所述检测引物组中，所述FIP引物和所述BIP引物的终浓度均为1.6μM，所述F3引物和所述B3引物的终浓度均为0.2μM，所述LF引物和所述LB引物的终浓度均为0.8μM。优选的，所述甜菜碱的终浓度为0.8mM。优选的，所述反应缓冲液中Mn2+的终浓度为0.6mM、Mg2+的终浓度为6.0mM。优选的，所述dNTPs的终浓度为1.0mM。优选的，所述显色剂的终浓度为50μM。优选的，所述BstDNA聚合酶的终浓度为0.32U/μL。更优选的，所述显色剂为钙黄绿素。本专利技术的第七方面，上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法用于检测霍乱弧菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术基于LAMP针对每个目标靶基因设计六条特异性引物，识别靶基因六个特定区域，降低了非特异性扩增，增强了检测的特异性；整个扩增反应在65℃恒温条件下40min内完成；不需要打开PCR反应管，避免了气溶胶引起的污染；也不需要特殊的检测设备，仅通过肉眼观测或在紫外光下观测即可判定检测结果；检测方法具有快速、简单、灵敏、特异的优势，尤其适用于大量样品快速筛查等方面。附图说明图1是实施例1中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因hlyA的检测灵敏度结果；其中，反应管号0～10依次表示霍乱弧菌基因组DNA模板的10倍梯度稀释，即192.371ng/μL～192.371×10-10ng/μL，11表示空白对照；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道0～11与反应管号一致，M：DNA分子量Marker；图2是实施例2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物和LB引物。
【技术特征摘要】
1.霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物和LB引物。2.如权利要求1所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，所述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因包括溶血素A(hlyA)、毒素中肌纤蛋白交叉连接重复子A(rtxA)、不耐热溶血素(tlh)的编码基因。3.如权利要求1或2所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，针对所述hlyA基因，所述FIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1；所述BIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.2；所述F3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3；所述B3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.4；所述LF引物的核苷酸序列为SEQIDNo.5；所述LB引物的核苷酸序列为SEQIDNo.6。4.如权利要求1或2所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，针对所述rtxA基因，所述FIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.7；所述BIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.8；所述F3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.9；所述B3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.10；所述LF引物的核苷酸序列为SEQIDNo.11；所述LB引物的核苷酸序列为SEQIDNo.12。5.如权利要求1或2所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，针对所述tlh基因，所述FIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.13；所述BIP引物的核苷酸序列为SEQIDNo.14；所述F3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.15；所述B3引物的核苷酸序列为SEQIDNo.16；所述LF引物的核苷酸序列为SEQIDNo.17；所述LB引物的核苷酸序列为SEQIDNo.18。6.如权利要求1～5任一项所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备治疗或诊断霍乱疾病药物中的应用。7.如权利要求1～5任一项所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备核酸扩增试剂中的应用。8.一种霍乱弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5任...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈兰明，许梦婕，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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