本发明专利技术属于发酵生产领域，具体涉及一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法，该发酵培养过程中的综合条件为：初始pH值8.25、转速169r/min、温度30.24℃、装液量37.9％和接种量1.46％；营养成份配比为：葡萄糖11.4g/L、酵母粉5g/L、硫酸锌0.00056g/L和氯化钙0.0595g/L，培养时间为24h，采用的发酵菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SX3411。枯草芽孢杆菌SX3411发酵液中粗分离Subtilomycin时，20％、30％和40％的硫酸铵沉淀发酵液可检测到Subtilomycin的抗菌活性，其中30％硫酸铵沉淀可获得最大量的Subtilomycin。将发酵液的30％硫酸铵沉淀用pH7.4、浓度50mmol/L的磷酸缓冲液悬浮，再通过3kD的超滤离心管，即可得到初步纯化的Subtilomycin。
【技术实现步骤摘要】
一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法
本专利技术涉及从一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法，属于发酵生产领域。
技术介绍
羊毛硫细菌素(Lantibiotics)是一种在细菌中产生的，由基因编码，于核糖体上合成，翻译后加工修饰，含有硫醚环的一类多环的抗菌肽。已经在多种革兰氏阳性细菌中发现有羊毛硫细菌素，其大多数对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，其中的乳酸菌素Nisin是羊毛硫细菌素的代表，在食品防腐中有应用。根据羊毛硫细菌素生物合成机制中催化形成羊毛硫氨酸的酶特性，羊毛硫细菌素可分成四类：I类羊毛硫细菌素的修饰主要由两种酶完成，即一种脱水酶(dehydratase)LanB和一种环化酶(cyclase)LanC；II类羊毛硫细菌素，其合成反应只有单一的羊毛硫肽合成酶(lanthipeptidesynthetase)LanM催化，该酶N-端为脱水酶域，但与LanB不同源，C-端为LanC类(LanC-like)环化酶域；III类羊毛硫细菌素和IV类羊毛硫细菌素合成分别由三功能酶LanKC和LanL作用。LanKC和LanL含有N-端裂解酶(lyase)域和中心激酶域，但有不同的C-端；LanC以及LanM和LanL的C-端域含有锌结合基序(Cys-Cys-His/Cys)，而LanKC的C-端环化酶域没有锌结合基序。羊毛硫细菌素对革兰氏阳性菌的作用有特异性，包括许多对抗生素耐药性(antibioticresistant)病原菌，如耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcusaureus，VRSA)、耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistantEnterococci，VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)等。研究显示羊毛硫肽细菌素可与细胞壁的前体物质lipidII结合，从而妨碍细胞壁的正常合成引起细胞的灭亡。除这种抑菌机理外，羊毛硫细菌素与lipid形成多聚物，使细胞膜形成孔道，因而让细菌细胞内容物流失而引起死亡。因为羊毛硫细菌素具有两种截然不同的抑菌机理，病原细菌非常不容易同时进化出针对二种抗菌机理的抗药性，这让病原细菌不容易产生针对羊毛硫细菌素的抗药性。相比传统抗生素只有单一的抑菌机理而导致抗药性的产生，羊毛硫细菌素的抑菌机理明显占据优势，且羊毛硫细菌素有较好的理化特性。因而，羊毛硫细菌素在食品、医药和饲料等相关领域具有极好的利用前景。Subtilomycin是2013年在枯草芽孢杆菌MMA7中发现的Ⅰ类羊毛硫细菌素。来自爱尔兰的RobertW.Phelan等人从海洋中的海绵(Haliclonasimulans)上得到枯草芽孢杆菌菌株MMA7，该菌株即分泌一种新型羊毛硫细菌素Subtilomycin。Subtilomycin基因簇包括结构基因SubA，两个修饰酶基因SubB(LanB-likedehydratase)和SubC(LanC-likecyclase)，胞外丝氨酸蛋白酶SubP(负责前导肽的切割)，ABC转运蛋白SubT和免疫蛋白SubI(可以使自身生长不受Subtilomycin的影响)。Subtilomycin对临床上和食品中的病原性革兰氏阳性菌表现抑菌活性，包括单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、产芽孢梭状杆菌(Clostridiumsporogenes)、MRSA和异质性万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌(heterogeneousvancomycin-intermediate-level-resistantStaphylococcusaureus，hVISA)等革兰氏阳性菌，同时对一些革兰氏阴性菌也具有抑菌活性，如：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和单孢菌属(Alteromonassp)等。但需要更大浓度的Subtilomycin才具有对革兰氏阴性菌的抑菌作用。我们在前期也从江西省南昌市麻丘镇一养猪场附近分离到一株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SX3411菌株，该菌株可以产羊毛硫细菌素Subtilomycin。菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCCNO.14396。鉴于Subtilomycin具有广谱的抗菌活性、热稳定性、耐酸碱性和水溶性等特征，使得Subtilomycin具有良好的药用价值，且非常适于进行规模化的工业生产，使其具有良好的在食品、医药和饲料等相关领域的加工和应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法，该方法为：(1)发酵菌种：发酵菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SX3411，该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCCNO.14396；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SX3411菌株通过分子生物学方法和immunobloting杂交分析，证明其产生了羊毛硫细菌素Subtilomycin。所述枯草芽孢杆菌SX3411在37℃的培养温度下，在不同时间取样，并调成相同菌液浓度，即OD600值为1.0。在细胞生物量基本相同的情况下Immunoblotting分析检测Subtilomycin前体蛋白SubA在细胞内的表达量变化：枯草芽孢杆菌SX3411在5h时开始胞内表达SubA蛋白，在第12h时表达量最高，随着时间的推移表达量逐渐减少，直至25h时全部消失，25h后再无SubA的表达。所述枯草芽孢杆菌SX3411采用27℃、30℃、33℃、37℃、40℃、43℃的温度培养12h后取样，并调成相同菌液浓度，即OD600值为1.0。在细胞生物量基本相同的情况下Immunoblotting分析检测Subtilomycin前体蛋白SubA在细胞内的表达量变化：6种培养温度下均有SubA的表达，即温度在27℃至43℃之间均可以表达SubA，其中在33℃左右时表达量最高，43℃左右时表达量最低。(2)发酵时间：发酵培养枯草芽孢杆菌SX3411产生Subtilomycin的发酵时间为24-30小时；进一步地以发酵24小时为宜；(3)发酵综合培养条件为：初始pH值8.25，转速169r/min，温度30.24℃，装液量37.9％，接种量1.46％；(4)发酵培养基的组分为：葡萄糖11.4g/L，酵母粉5g/L，硫酸锌0.00056g/L，氯化钙0.0595g/L。初步纯化发酵液中Subtilomycin的步骤为：(1)采用20％-40％的硫酸铵对发酵液进行沉淀，得到发酵液硫酸铵沉淀；(2)将发酵液硫酸铵沉淀用pH7.4、浓度50mmol/L的磷酸缓冲液悬浮沉淀，再通过3kD的超滤离心管，即可得到初步纯化的Subtilomycin。优选的，初步纯化发酵液中Subtilomycin的步骤为：(1)采用30％的硫酸铵对发酵液进行沉淀，得到发酵液硫酸铵沉淀；(2)将发酵液硫本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法，其特征在于：(1)发酵菌种：发酵菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SX3411，该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC NO.14396；(2)发酵时间：发酵培养枯草芽孢杆菌SX3411产生Subtilomycin的发酵时间为24‑30小时；(3)发酵综合培养条件为：初始pH值8.25，转速169r/min，温度30.24℃，装液量37.9％，接种量1.46％；(4)发酵培养基的组分为：葡萄糖11.4g/L，酵母粉5g/L，硫酸锌0.00056g/L，氯化钙0.0595g/L。
【技术特征摘要】
1.一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法，其特征在于：(1)发酵菌种：发酵菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SX3411，该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCCNO.14396；(2)发酵时间：发酵培养枯草芽孢杆菌SX3411产生Subtilomycin的发酵时间为24-30小时；(3)发酵综合培养条件为：初始pH值8.25，转速169r/min，温度30.24℃，装液量37.9％，接种量1.46％；(4)发酵培养基的组分为：葡萄糖11.4g/L，酵母粉5g/L，硫酸锌0.00056g/L，氯化钙0.0595g/L。2.根据权利要求1所述一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilom...
【专利技术属性】
技术研发人员：付鸣佳，柒林花，肖世平，叶德晓，钟雪晴，杨志海，
申请(专利权)人：江西天佳生物工程股份有限公司，江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36
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