一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒及方法，试剂盒的组份包括：去糖缓冲液、裂解液、抽提液、过柱缓冲液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液和DNA吸附柱；提取方法是先进行植物中多糖的去除，再进行DNA提取，并且后续的抽提和过柱步骤可以再次去除多糖，使得提取的DNA质量高，不含杂质。本发明专利技术适合富含多糖、多酚等大量次生代谢物的植物基因组DNA的提取；本发明专利技术具有成本低、操作简便快捷、高质高效、适用性广等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒及方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒及方法。
技术介绍
在分子生物学实验中，从细胞中分离提取的DNA质量对于许多后续分子生物学实验至关重要，例如，限制性酶切分析、Southern印迹、DNA文库的构建等实验的成败在很大程度上取决于DNA的质量，而提取方法是影响DNA质量的一个重要因素。目前，在植物基因组DNA的提取中，最常用的方法是经典的CTAB(Cetyl-trimethyl-ammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(Sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸钠)法，但这些方法通常只适用于含多糖多酚等次生物质较低的植物。由于不同物种以及同一物种不同组织所含内含物的差异，导致其DNA提取难易程度不同。比如对于富含多糖、多酚类物质的顽拗植物（如西南桦、黄秋葵），利用这些常规操作则很难获得高质量的DNA，甚至无法获得DNA。曾杰等(2002)以西南桦为例发展了一种顽拗植物DNA制备方案。此方案首先用不含裂解液的Tris-HCl缓冲液洗去细胞匀浆中大部分多糖和其他次生物质。近年来，此法在其它顽拗植物基因组DNA提取中得以借鉴和参考。如黄捷等(2008)在提取黄秋葵基因组DNA时，采用不含CTAB的缓冲液除去大部分的多糖，随后采用两步沉淀法，即先用异丙醇沉淀，再用乙醇沉淀，去除剩余的多糖。此法操作步骤繁琐，耗时秏力，难以适应科研快速发展的需求。黄秋葵是含果胶类多糖极高的顽拗植物。Manoj-KumarA等(2012)报道了一种改良的CTAB法结合果胶酶消化果胶，提取黄秋葵基因组DNA的方法。此法虽能获得高质量的DNA,但也存在操作步骤繁琐、耗时长，实验成本高等缺点。常规的CTAB法和SDS法在用异丙醇或无水乙醇沉淀DNA时，果胶类多糖会与DNA结合形成复合物，一起被沉淀，使得DNA包埋其中而难以溶解，或溶解后产生黏稠状的溶液。使用常规试剂盒时，大量的多糖会堵塞吸附柱，提取的DNA量极低，甚至不能获得DNA。因此，采用现有技术难于从富含果胶类多糖的植物中获得高质高量的基因组DNA。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术为了解决上述存在之不足，提供一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒及方法，主要对富含多糖、多酚以及其他大量次生代谢物的植物DNA进行高效提取，使得提取的DNA质量高。本专利技术具有成本低、操作简便快捷、高质高效、适用性广等特点。本专利技术的专利技术人通过长期的探索尝试以及多次的实验和努力，不断改革与创新，为解决以上技术问题，所采用的具体技术方案是提供一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒及方法。本专利技术首先提供了一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其组成包括：去糖缓冲液：Tris-HCl，NaCl，EDTA，β-巯基乙醇；裂解液：CTAB，Tris-HCl，EDTA，NaCl，β-巯基乙醇；抽提液：氯仿，异戊醇；过柱缓冲液：盐酸胍，Tris-HCl，EDTA；去蛋白液：盐酸胍，Tris-HCl，乙醇；漂洗液：NaCl，Tris-HCl，乙醇；洗脱液：Tris-HCl，EDTA；DNA吸附柱。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其进一步的技术方案是：所述去糖缓冲液由100mmol/L—200mmol/LTris-HCl，150mmol/L—250mmol/LNaCl，20mmol/L—50mmol/LEDTA，0.5%—2%β-巯基乙醇组成；裂解液由2%—3%CTAB，100mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，1.5mol/LNaCl，0.5%—2%β-巯基乙醇组成；抽提液：氯仿与异戊醇的体积比为24:1；过柱缓冲液由4mmol/L—6mmol/L盐酸胍，20mmol/L—50mmol/LTris-HCl，5mmol/L—10mmol/LEDTA组成，pH为4.5-6.8；去蛋白液由4mmol/L—6mmol/L盐酸胍，10mmol/L—20mmol/LTris-HCl，30%-40%乙醇组成，pH为6.5；漂洗液由10mmol/L—20mmol/LNaCl，10mmol/L—20mmol/LTris-HCl，70%-80%乙醇组成，pH为7.5；洗脱液由1mmol/L—10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/L—1mmol/LEDTA组成，pH为8.0-8.5。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其进一步的技术方案是：所述去糖缓冲液由200mmol/LTris-HCl，250mmol/LNaCl，50mmol/LEDTA，1%β-巯基乙醇组成；裂解液由3%CTAB，100mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，1.5mol/LNaCl，1%β-巯基乙醇组成；抽提液：氯仿与异戊醇的体积比为24:1；过柱缓冲液由5mol/L盐酸胍，50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA组成，pH为6.5；去蛋白液由5mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，38%乙醇组成，pH为6.5；漂洗液由20mmol/LNaCl，20mmol/LTris-HCl，75%乙醇组成，pH为7.5；洗脱液由10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA组成，pH为8.5。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其进一步的技术方案是：去糖缓冲液和裂解液中的Tris-HCl缓冲液和EDTA溶液的pH值为8.0-8.5。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其进一步的技术方案是：β-巯基乙醇在去糖缓冲液和裂解液使用时加入。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其进一步的技术方案是：所述DNA吸附柱为硅胶膜吸附柱。一种提取富含果胶类多糖植物DNA的方法，依次包括以下步骤：（1）样品处理：将新鲜植物样品研碎，收集到离心管中备用；（2）去多糖：向离心管中加入去糖缓冲液和β-巯基乙醇混合均匀，离心，弃上清液，收集沉淀；（3）裂解：向沉淀中加入裂解液、RNaseA和β-巯基乙醇混合均匀，离心，收集上清液；（4）去蛋白：向上清液中加入等体积的抽提液，颠倒混匀，离心，取上清，得到DNA粗提液；（5）向粗提液中加入等体积的过柱缓冲液，颠倒混匀；将DNA吸附柱放入收集管中，取部分混合液加入吸附柱中静置，离心，弃滤液；再将剩余的混合液加入吸附柱中静置，离心，弃滤液；（6）DNA纯化：先向上述吸附柱中加入去蛋白液来清洗吸附柱,离心倒掉废液；再加入漂洗液，离心倒掉废液；（7）回收DNA：将上述吸附柱转移至新的离心管中，然后加入预热的洗脱液，先静置,再离心，即得DNA样品。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的方法，其进一步的技术方案是：步骤（1）中研磨时加入液氮。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的方法，其进一步的技术方案是：步骤（2）中去糖缓冲液要在4℃预冷后加入，混合均匀后，将溶液放入4℃冰箱10min。根据本专利技术所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的方法，其进一步的技术方案是：步骤（3）中裂解液要在65℃下预热后加入，且混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：去糖缓冲液：Tris‑HCl，NaCl，EDTA，β‑巯基乙醇；裂解液：CTAB，Tris‑HCl，EDTA，NaCl，β‑巯基乙醇；抽提液：氯仿，异戊醇；过柱缓冲液：盐酸胍，Tris‑HCl，EDTA；去蛋白液：盐酸胍，Tris‑HCl，乙醇；漂洗液：NaCl，Tris‑HCl，乙醇；洗脱液：Tris‑HCl，EDTA；DNA吸附柱。

【技术特征摘要】
1.一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：去糖缓冲液：Tris-HCl，NaCl，EDTA，β-巯基乙醇；裂解液：CTAB，Tris-HCl，EDTA，NaCl，β-巯基乙醇；抽提液：氯仿，异戊醇；过柱缓冲液：盐酸胍，Tris-HCl，EDTA；去蛋白液：盐酸胍，Tris-HCl，乙醇；漂洗液：NaCl，Tris-HCl，乙醇；洗脱液：Tris-HCl，EDTA；DNA吸附柱。2.根据权利要求1所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其特征在于：所述去糖缓冲液由100mmol/L—200mmol/LTris-HCl，150mmol/L—250mmol/LNaCl，20mmol/L—50mmol/LEDTA，0.5%—2%β-巯基乙醇组成；裂解液由2%—3%CTAB，100mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，1.5mol/LNaCl，0.5%—2%β-巯基乙醇组成；抽提液：氯仿与异戊醇的体积比为24:1；过柱缓冲液由4mmol/L—6mmol/L盐酸胍，20mmol/L—50mmol/LTris-HCl，5mmol/L—10mmol/LEDTA组成，pH为4.5-6.8；去蛋白液由4mmol/L—6mmol/L盐酸胍，10mmol/L—20mmol/LTris-HCl，30%-40%乙醇组成，pH为6.5；漂洗液由10mmol/L—20mmol/LNaCl，10mmol/L—20mmol/LTris-HCl，70%-80%乙醇组成，pH为7.5；洗脱液由1mmol/L—10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/L—1mmol/LEDTA组成，pH为8.0-8.5。3.根据权利要求2所述的一种提取富含果胶类多糖植物DNA的试剂盒，其特征在于：所述去糖缓冲液由200mmol/LTris-HCl，250mmol/LNaCl，50mmol/LEDTA，1%β-巯基乙醇组成；裂解液由3%CTAB，100mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，1.5mol/LNaCl，1%β-巯基乙醇组成；抽提液：氯仿与异戊醇的体积比为24:1；过柱缓冲液由5mol/L盐酸胍，50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张景荣，卓明，刘玉珊，叶昌华，唐宵铧，李臻，杨马进，王辉，
申请(专利权)人：四川省植物工程研究院，
类型：发明
国别省市：四川,51