本发明专利技术公开了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉；细胞裂解：加入DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，混匀后在65℃水浴30min；DNA提取：加入0.33mL浓度为KAc，冰浴20min，后酚:氯仿:异戊醇抽提，离心，取上清液加入无水乙醇沉淀，低温静置30min，离心收集沉淀；纯化处理：加入RNaseA，在37℃处理30min，后25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，低温离心5min；取上清液加入无水乙醇沉淀，挑取沉淀，漂洗，风干，溶于TE缓冲液中，保存备用。采用本方法提取的丝状真菌DNA量提高2倍，浓度达到277ng/μL，片段长≥20000bps，无降解，纯度高。
【技术实现步骤摘要】
一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法。
技术介绍
真菌为低等真核生物，种类庞大而多样，近几年，随着高通量测序技术的提高，更多真菌完成了基因组测序。基因组学的深入分析促进了生物进化、系统发生学、药物靶基因、新基因和新编辑方式的发现及功能等研究。真菌基因组DNA的长度、浓度、纯度直接关系到真菌基因组的测序、组装和注释。在文库构建和高通量测序过程中，高质量和长片段的真菌基因组DNA能够减少拼接误差，更好的反映原始基因调控序列和基因结构，便于基因功能和表达调控模式注释。因此，简便快捷地提取高质量、长片段丝状真菌基因组DNA提取方案在高通量测序、基因工程领域尤为重要。迄今，对于从真菌中提取染色体的方法已有许多研究，其中较为有效的方法是酶解法、氯化苄法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基磺酸钠(SDS)法等，后两种由于无需昂贵仪器和药品，应用更广泛。但是现有这4种常规真菌基因组DNA提取方法主要应用于真菌子实体DNA的提取，而非新鲜培养的菌丝体DNA的提取，且提取效率较低(时间长、产量低)、质量较低(片段长度短、存在蛋白残留及降解产物)。由于真菌子实体组织结构紧密，细胞壁结构坚固，且多数实验样本为干燥或多年生子实体，其中色素、多糖等次生代谢产物丰富，如白僵菌子实体含有20种多糖，约占白僵菌总干质量3％-8％；这些不利因素给真菌基因组DNA的提取带来巨大困难，导致提取操作繁琐，时间较长，成本较高；提取产物的产量较低，降解严重，蛋白、色素等残留较多，纯度较低。而组织材料新鲜是提取高质量真菌基因组DNA的关键，尤其是色素、多糖含量较高的真菌。新鲜培养的真菌菌丝体，多糖、色素等次生代谢产物含量较低，细胞分裂增殖活跃，DNA含量丰富，且真菌基因工程操作多数以菌丝体为操作对象。但新鲜真菌菌丝体含水率高，导致液氮研磨不充分；活性酶含量高，导致DNA易降解、操作过程中长链易于断裂；此外，现有的离体真菌DNA提取方法不适用于新鲜菌丝的DNA提取，且操作时间较长(≥10h)，尤其是裂解液裂解能力越强，提取率越高，但DNA片段短；反之亦然。因此还未有一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，解决了现有技术存在的问题。本专利技术提供了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括以下步骤：S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；S102细胞裂解：加入1mL65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃水浴30min；S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5MKAc，冰浴20min，后加入1.5倍体积的比例为25:24:1苯酚:氯仿:异戊醇抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，在5000rpm下离心收集沉淀，用75％乙醇漂洗若干次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μLTE缓冲液中；S104纯化处理：加入20μL浓度为10mg/mLRNaseA，在37℃处理30min，后用800μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和800μL体积比为24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀30min，挑取沉淀，用75％乙醇漂洗，风干，溶于500μLTE缓冲液中，在-20℃保存备用。优选地，S101步骤中，离心滤去菌丝质量70-75％的水分。优选地，DNA提取缓冲液包含0.1mol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，0.05mol/LEDTA，3％SDS，在快速提取长片段DNA的同时防止DNA降解。优选地，TE缓冲液为10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。优选地，真菌为白僵菌或蛹虫草。采用本专利技术所提供的一种快速提取长片段测序用丝状真菌DNA的方法，采用新鲜菌丝体70％-75％脱水，便于菌丝的液氮研磨破碎和裂解；采用一定配比蛋白酶K和3％SDS混合体系来裂解菌丝细胞并提取DNA，不仅提高裂解效率，节省实验时间3-4h，在影响新鲜菌丝体的DNA活性前提下保留DNA长片段的同时实现高提取率，另外采用RNaseA处理、酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次、低温高速离心、无水乙醇沉淀、75％乙醇漂洗既可以在温和条件下纯化DNA，20000bp及以上的长片段提取产量较传统方法提高1倍以上。本专利技术方法快速制备的20000bp及以上的长片段DNA可直接用于文库构建和高通量测序，减少拼接误差，更好的反映原始基因调控序列和基因结构，便于基因功能和表达调控模式注释。附图说明图1为实施例一的白僵菌菌丝示意图；图2为实施例一的S101步骤中液氮研磨成细粉状的示意图；图3为实施例一的S102步骤中细胞裂解液的示意图；图4为实施例一的S103步骤中加入无水乙醇后出沉淀物的示意图；图5为实施例一的S104步骤中加入无水乙醇后出絮状沉淀物的示意图；图6为实施例一和实施例二所提取DNA溶液的电泳检测结果，DNA片段大小基本为20000bps，M为λ/HindIIIDNAMarker，T1为本专利技术方法(实施例一和实施例二)提取获得的DNA溶液，T2为现有方法(对比例3和对比例4)获得的溶液；图7为实施例一所提取DNA溶液的分光光度计检测结果，其中A260/280＝1.78，A260/230＝2.32，浓度为277ng/μL；图8为实施例二所提取DNA溶液的分光光度计检测结果，其中A260/280＝1.80，A260/230＝3.11，浓度为122ng/μL。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术实施例中的菌株是由中国热带农业科学院环境与植物研究所提供，使用现有方法可自主培养，蛋白酶K等药品试剂购自于试剂公司。实施例一：一种从新鲜白僵菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括以下步骤：S101菌体准备：取7.5cm平板上，培养4d的白僵菌菌丝(如图1)，放入离心管中在12000rpm下离心2min，去除75％的水分，后称取菌丝0.25g，在液氮中迅速研磨成粉(如图2)；S102细胞裂解：加入1mL65℃预热的DNA提取缓冲液(DNA提取缓冲液：0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5mol/LNaCl，0.05mol/LEDTA，质量浓度为3％的SDS)，加入60μL蛋白酶K(20mg/mL)，(如图3)快速振荡混匀，在65℃水浴30min，期间混匀3次；S103DNA提取：加入0.33mL5mol/LKAc，冰浴20min，后加入1.5倍体积的苯酚(0.1MTris饱和酚，pH>7.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，快速离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃下水浴30min；S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5mol/L KAc，冰浴20min，后加入0.5mL体积比例为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇溶液抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，在5000rpm下离心收集沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗若干次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE缓冲液中；S104纯化处理：加入20μL浓度为10mg/mL RNaseA，在37℃处理30min，后用800μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和800μL体积比为24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇，在‑20℃沉淀30min，挑取沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗，风干，溶于500μL TE缓冲液中，在‑20℃保存备用。...
【技术特征摘要】
1.一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，快速离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；S102细胞裂解：加入1mL65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃下水浴30min；S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5mol/LKAc，冰浴20min，后加入0.5mL体积比例为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇溶液抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，在5000rpm下离心收集沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗若干次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μLTE缓冲液中；S104纯化处理：加入20μL浓度为10mg/mLRNaseA，在37℃处理30min，后用800μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和800μL体积比为24...
【专利技术属性】
技术研发人员：耿涛，王树昌，武华周，郭锡杰，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46
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