一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用技术

本发明专利技术提供了一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana(Bals.)Vuill)微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用，属于微菌核制剂制备技术领域，所述球孢白僵菌微菌核制剂的制备包括以下步骤：1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；2)取制备得到的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；3)取制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；4)将获得的干制微菌核与助剂混合后得到微菌核制剂。该方法生产的球孢白僵菌微菌核制剂生产成本低、产品耐受性强，且该制剂复水后能够迅速萌发长出菌丝并产生分生孢子侵染害虫，具有良好杀虫活性。

【技术实现步骤摘要】
一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用
本专利技术涉及微菌核制剂制备
，尤其涉及一种球孢白僵菌微菌核的制备方法及应用。
技术介绍
随着我国生态文明建设的推进，减少化学农药的使用已成必然趋势，环境友好的生物防治技术更受人青睐。球孢白僵菌是一种广谱型病原真菌，对多种鳞翅目、鞘翅目、半翅目害虫均有良好杀虫活性，被广泛应用于国内外多种害虫如小地老虎、松毛虫等的生物防治。目前实际应用的球孢白僵菌制剂含有的有效成分通常是球孢白僵菌分生孢子，而分生孢子是利用液固两相发酵获得，该方式的弊端是发酵周期长，生产效率低，生产成本高，且产品对不良环境的耐受力有限，货架期短，因此在实际生产和应用中受到很大的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用，该方法生产的球孢白僵菌微菌核制剂生产成本低、产品耐受性强，并且该制剂复水后能够迅速萌发长出菌丝并产生孢子侵染害虫，具有良好杀虫活性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，包括以下步骤：1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；2)取步骤1)中的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；步骤1)中所述吐温20水溶液中吐温20的体积百分含量为0.03％～0.1％；步骤2)中所述的液体诱导培养基以水为溶剂，每升包括以下组分：KH2PO42～6g、MgSO4·7H2O0.3～0.9g、NaNO30.4～1.2g、CuSO40.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g和吐温202.5mL～7.5mL，pH6.0～7.5。优选的，所述球孢白僵菌菌株为CQBb119，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为：CGMCCNO:15987。优选的，步骤1)中所述孢子悬浮液的孢子含量为2.8×106～3.2×106个孢子/mL。优选的，步骤2)中所述接种的孢子悬液与液体诱导培养基的体积比为1:(10～20)。优选的，步骤2)中所述诱导培养的温度为23～31℃；所述诱导培养的时间为5～6d；所述诱导培养的振荡或搅拌频率50～250rpm。本专利技术提供了一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，包括以下步骤：A)取权利要求1～5任意一项所述方法制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；B)将步骤A)中的干制微菌核与助剂混合后得到微菌核制剂。优选的，所述球孢白僵菌微菌核制剂的剂型为颗粒剂。优选的，步骤A)中所述填料为硅藻土、淀粉和环糊精中的一种或几种；所述液体微菌核与填料的体积比为1：(2～4)。优选的，步骤B)中所述助剂为蔗糖酯；所述干制微菌核与蔗糖酯的质量比为1000:1～200:1。本专利技术提供了上述方案制备得到的球孢白僵菌微菌核制剂在防治多种害虫中的应用。本专利技术的有益效果：1、本专利技术采用生物保藏编号为CGMCCNO:15987的球孢白僵菌，其本身具有杀虫活性高，杀虫谱广的优良特性，尤其对于普通杀虫剂难于防治的刺吸式口器的同翅目昆虫、鳞翅目的小地老虎及双翅目害虫幼虫具有很强的杀虫活性。并且本申请首次使用液体发酵大量诱导产生球孢白僵菌微菌核。2、利用本申请的方法制备的球孢白僵菌微菌核制剂能适应35～40℃的温度及强紫外线等外界不良环境，产品抗逆性好，货架期为1～2年。3、本专利技术生产的球孢白僵菌微菌核制剂复水后能够迅速萌发长出菌丝并产生孢子侵染害虫，具有良好杀虫活性，LT50(半致死时间：接种后50％害虫死亡所经历的时间)为5.3d～7.2d，可以替代分生孢子作为杀虫真菌的有效成分。4、本专利技术的发酵工艺简单，原料常规，所用培养液和发酵工艺可操作性强，重复性好，可以实现全自动化生产；并且本专利技术的发酵周期短，仅需5～6d，而传统的液固两相发酵则需要耗时20～25d。5、本专利技术的生产成本较分生孢子发酵生产成本降低1/2以上，而且生产过程无废料产生。生物保藏说明球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)，于2018年6月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为：CGMCCNO:15987。具体实施方式本专利技术提供了一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，所述球孢白僵菌菌株为CQBb119，保藏编号为：CGMCCNO:15987。在本专利技术中，将球孢白僵菌菌种接种于PDA固体培养基中进行菌种培养，收集获得分生孢子；所述PDA平板的直径优选为90mm；所述菌种培养时间优选为10～12d；所述菌种培养温度优选为23～25℃；所述收集方法优选为待菌丝长满平板并产孢后刮取平板表面的分生孢子。在本专利技术中，将收集到的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；所述吐温20水溶液中吐温20的含量为0.03％～0.1％，优选为0.05％；所述吐温20水溶液中的水为无菌水；所述孢子悬液的终浓度为2.8×106～3.2×106个孢子/mL，优选为3.0×106个孢子/mL；所述混合过程在无菌环境中进行。在本专利技术中，将获得的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；所述液体诱导培养基包括以下组份：以1L计，KH2PO42～6g、MgSO4·7H2O0.3～0.9g、NaNO30.4～1.2g、CuSO40.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g、吐温200.25～0.75mL和1000mL水，pH6.0～7.5；优选的，以1L计，KH2PO43～5g、MgSO4·7H2O0.5～0.7g、NaNO30.8～1.0g、CuSO40.3～0.5g；酵母粉2.5～3.5g、蛋白胨1.5～2.5g、蔗糖15～25g、吐温200.35～0.65mL和1000mL水，pH6.5～7.2；更优选的以1L计，KH2PO44g、MgSO4·7H2O0.6g、NaNO30.9g、CuSO40.4g；酵母粉3g、蛋白胨2g、蔗糖20g、吐温200.5mL和1000mL水，pH7.0。在本专利技术中，所述接种的孢子悬液与液体诱导培养基的体积比为1:(10～20)，优选为1：(12～18)，更优选为1：15；所述接种后的孢子终含量优选为≧1.25×105个孢子/L。本专利技术中，所述诱导培养的温度为23～31℃，优选为25～29℃，更优选为28℃；所述诱导培养的时间为5～6d，优选为5.5d；所述诱导培养的振荡频率为50～250rpm，在本专利技术具体实施过程中，优选的在接种后24h内振荡频率优选为50～100rpm，更优选为100rpm；接种后24h之后振荡频率优选为110～200rpm，更优选为180rpm。本专利技术提供了一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，所述球孢白僵菌微菌核由上述方案制备获得。在本专利技术中，取上述方案中制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；本专利技术中，所述填料为硅藻土、淀粉和环糊精中的一种或几种；所述微菌核与填料的质量比为1：(2～4)，优选为1:3；所述干燥处理的方式优选为干热风干燥；所述干燥处理的温度优选为30～40℃，更优选为32℃；所述干燥处理的时间优选为24～48h，更优选为36h。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，包括以下步骤：1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；2)取步骤1)中的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；步骤1)中所述吐温20水溶液中吐温20的体积百分含量为0.03％～0.1％；步骤2)中所述的液体诱导培养基以水为溶剂，每升包括以下组分：KH2PO4 2～6g、MgSO4·7H2O 0.3～0.9g、NaNO3 0.4～1.2g、CuSO4 0.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g和吐温202.5mL～7.5mL，pH 6.0～7.5。

【技术特征摘要】
1.一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，包括以下步骤：1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；2)取步骤1)中的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；步骤1)中所述吐温20水溶液中吐温20的体积百分含量为0.03％～0.1％；步骤2)中所述的液体诱导培养基以水为溶剂，每升包括以下组分：KH2PO42～6g、MgSO4·7H2O0.3～0.9g、NaNO30.4～1.2g、CuSO40.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g和吐温202.5mL～7.5mL，pH6.0～7.5。2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌微菌核的制备方法，其特征在于，所述球孢白僵菌菌株为CQBb119，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为：CGMCCNO:15987。3.根据权利要求1所述的球孢白僵菌微菌核的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述孢子悬浮液的孢子含量为2.8×106～3.2×106个孢子/mL。4.根据权利要求1所述的球孢白僵菌微菌核的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述接种的孢子悬液与...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷幼平，高熊枫，王中康，代雨灿，蒋晨，梅礼刚，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50