一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒。本发明专利技术的多重扩增建库方法可以实现以痕量DNA甚至单细胞水平的DNA为模板进行多重扩增测序，且全部反应过程可在单管内实现。通过实验证明：本发明专利技术的建库方法在单细胞的水平上实现了多达207重的一管式扩增子扩增，且保真度高于现有的商品化试剂盒，不仅具有操作便捷、成本经济、测序质量高和灵敏度高的优点，而且还可以满足两个测序平台的测序需求。适用于高通量低频突变检测领域如ctDNA突变检测领域以及低起始量DNA的胚系突变检测领域如单细胞突变检测筛选。

A Multiplex Amplification Library Method for Trace DNA and Its Special Kit

The invention discloses a multiplex amplification library method for trace DNA and a special kit thereof. The multiple amplification library method of the invention can realize multiple amplification and sequencing using trace DNA or even single cell level DNA as template, and the whole reaction process can be realized in a single tube. Experiments show that the library building method of the present invention achieves 207-fold one-tube amplifier amplification at the level of single cell, and its fidelity is higher than that of the existing commercial kits. It not only has the advantages of convenient operation, cost-saving, high quality and high sensitivity of sequencing, but also can satisfy the detection of two sequencing platforms. Ordinal demand. It is suitable for high-throughput and low-frequency mutation detection such as ctDNA mutation detection and embryonic mutation detection such as single cell mutation detection and screening.

【技术实现步骤摘要】
一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒。
技术介绍
扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，分析序列中的变异。扩增子测序可对目标区域进行高覆盖度的测序，便于低频突变检测，在探索复杂样本基因变异(例如具有异质性的体细胞突变等)进行测序等方面具有重要价值。在实际应用中，存在难度的是如何对低DNA起始量样本(包括有DNA降解的低起始量样本)进行高保真度的扩增子测序文库制备。现有的针对于低起始量的技术方案主要是Life公司的Ampliseq产品的多重扩增技术，其具有简单方便、扩增效率高和均一性好的优点，是一种良好的靶向测序技术。Ampliseq产品与iontorrent半导体测序平台捆绑，其扩增产物，在加入FuPa试剂消化后，去除引物序列。然后加入Life公司的iontorrent测序接头，最后基于iontorrent测序平台进行测序。利用10ngDNA，只需一天，即可快速评估数百个关键突变。但该技术通常采用不小于10ng起始量的DNA进行扩增反应，而且采用iontorrent半导体测序技术进行突变检测，碱基错误率相对较高，不适用于polyN类型变异检测，一定程度上限制了对痕量样品的变异检测，特别是低频突变的检测。此外，IonAmpliSeqTM技术的扩增酶体系的保真度相对不高，可能会影响到低频突变的检测。对基于超低起始量的痕量DNA甚至于单细胞水平的DNA模板的多重扩增鲜有报道。现在主流的基于扩增子测序平台主要包括Life公司的proton平台和Illumina公司的Hiseq平台，这两个公司分别有各自的样本扩增和建库的试剂盒。Life公司的相关试剂盒单轮运行成本较为经济、但受技术方法所限不适用于polyN类型变异检测，indel检测错误率相对较高。而Illumina平台虽然测序错误率相对较低，但其建库首先需要对核酸进行末端修复、磷酸化、加A等一系列反应，然后使用Y型粘端接头进行连接，连接完成进行文库扩增后才可进行测序，其成本高、步骤繁琐。由于两个平台所用的接头不同，使得建库产物在两个平台无法通用。因而开发一种可在两个平台通用的建库方法，综合两个平台的长处，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于痕量DNA的多重扩增建库试剂盒。本专利技术提供的试剂盒包括多重扩增体系、引物消化体系和接头连接体系；所述多重扩增体系包括DNA聚合酶、PCR缓冲体系和多重扩增引物；所述引物消化体系包括尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶，NEB)、尿嘧啶-N-糖化酶(UNG酶，Thermo)、核酸外切酶I(exonucleasei，Thermo)、8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg，NEB)和Klenow片段(KlenowFragment，NEB)中至少一种；所述接头连接体系包括测序接头、T4DNA连接酶和DNA连接酶缓冲液。进一步的，所述多重扩增体系中，所述DNA聚合酶可为PlatinumTaqDNA高保真聚合酶(Invitrogen)、PhusionUHotStartDNA聚合酶(Thermo)、KAPAHiFiHotStartDNA聚合酶(KAPA)、KAPA2GRobustDNA聚合酶(KAPA)、PfuTurboDNA聚合酶(Agilent)、KODDNA聚合酶(TOYOBO)和TaKaRaTaqDNA聚合酶(TaKaRa)中至少一种。所述PCR缓冲体系可以为DNA聚合酶的预混液，也可以为DNA聚合酶的缓冲液。所述多重扩增引物为IonAmpliSeqTMPrimerPool，所述IonAmpliSeqTMPrimerPool具体为2×IonAmpliSeqTMPrimerPool(Life)。所述接头连接体系中，所述T4DNA连接酶具体为T4DNALigase(NEB)；所述DNA连接酶缓冲液具体为DNALigaseBuffer(NEB)；所述测序接头可为Illumina测序接头或iontorrent测序接头。在实际应用中，可根据需要选择相应的接头。在本专利技术的一个实施例中，采用的Illumina测序接头为不同于传统IlluminaY型接头的平端接头illu_adaptor。具体的，所述平端接头illu_adaptor由接头甲和接头乙组成；所述接头甲是将单链DNA分子adoligo1与单链DNA分子adoligo3退火后得到的；所述单链DNA分子adoligo3与所述单链DNA分子adoligo1的3'端反向互补配对形成双链结构；所述接头乙是将单链DNA分子adoligo2与单链DNA分子adoligo3退火得到的；所述单链DNA分子adoligo3与所述单链DNA分子adoligo2的3'端反向互补配对形成双链结构。本专利技术的单链DNA分子adoligo3与单链DNA分子adoligo1或单链DNA分子adoligo2形成的双链结构其3'端均为平末端。所述单链DNA分子adoligo1与所述单链DNA分子adoligo2的5'端序列不同，可通过PCR方法，添加测序元件和样品barcode，用于扩增产物的平端连接，适用于Illumina测序平台。更具体的，所述单链DNA分子adoligo1的核苷酸序列如序列1所示；所述单链DNA分子adoligo2的核苷酸序列如序列2所示，所述单链DNA分子adoligo3的核苷酸序列如序列3所示。在本专利技术的另一个实施例中，采用的iontorrent测序接头为KAPAAdapterKitsIonTorrentTMPlatforms接头，适用于iontorrent的测序平台。更进一步的，所述多重扩增体系由PlatinumTaqDNA高保真聚合酶、PhusionUHotStartDNA聚合酶、KAPAHiFiHotStartDNA聚合酶、KAPA2GRobustDNA聚合酶、PfuTurboDNA聚合酶、KODDNA聚合酶和TaKaRaTaqDNA聚合酶中至少一种，2×IonAmpliSeqTMPrimerPool以及1×PCR缓冲体系组成。各酶在所述多重扩增体系中的浓度分别如下：所述PlatinumTaqDNA高保真聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL；所述PhusionUHotStartDNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL；所述KAPAHiFiHotStartDNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL；所述KAPA2GRobustDNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL；所述PfuTurboDNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL；所述KODDNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL；所述TaKaRaTaqDNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为(0～0.2)U/μL，优选为(0.01～0.2)U/μL。所述2×I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于痕量DNA的多重扩增建库试剂盒，其包括多重扩增体系、引物消化体系和接头连接体系；所述多重扩增体系包括DNA聚合酶、PCR缓冲体系和多重扩增引物；所述引物消化体系包括尿嘧啶‑DNA糖基化酶、尿嘧啶‑N‑糖化酶、核酸外切酶I、8‑氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶和Klenow片段中至少一种；所述接头连接体系包括测序接头、T4DNA连接酶和DNA连接酶缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种用于痕量DNA的多重扩增建库试剂盒，其包括多重扩增体系、引物消化体系和接头连接体系；所述多重扩增体系包括DNA聚合酶、PCR缓冲体系和多重扩增引物；所述引物消化体系包括尿嘧啶-DNA糖基化酶、尿嘧啶-N-糖化酶、核酸外切酶I、8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶和Klenow片段中至少一种；所述接头连接体系包括测序接头、T4DNA连接酶和DNA连接酶缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为PlatinumTaqDNA高保真聚合酶、PhusionUHotStartDNA聚合酶、KAPAHiFiHotStartDNA聚合酶、KAPA2GRobustDNA聚合酶、PfuTurboDNA聚合酶、KODDNA聚合酶和TaKaRaTaqDNA聚合酶中至少一种。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述测序接头由接头甲和接头乙组成；所述接头甲是将单链DNA分子adoligo1与单链DNA分子adoligo3退火后得到的；所述单链DNA分子adoligo3与所述单链DNA分子adoligo1的3'端反向互补配对形成双链结构；所述接头乙是将单链DNA分子adoligo2与单链DNA分子adoligo3退火后得到的；所述单链DNA分子adoligo3与所述单链DNA分子adoligo2的3'端反向互补配对形成双链结构；所述单链DNA分子adoligo1与所述单链DNA分子adoligo2的5'端序列不同；所述接头甲和所述接头乙均为平末端接头；或，所述单链DNA分子adoligo1的核苷酸序列如序列1所示；所述单链DNA分子adoligo2的核苷酸序列如序列2所示；所述单链DNA分子adoligo3的核苷酸序列如序列3所示；或，所述测序接头为iontorrent接头。4.权利要求1-3任一所述的试剂盒在痕量DNA文库构建中的应用；或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在痕量DNA低频变异检测中的应用。5.一种利用权利要求1-3任一所述的试剂盒进行痕量DNA文库建库的方法，包括如下步骤：1)将DNA样本加入权利要求1-3中任一所述的多重扩增体系进行多重PCR扩增，得到多重扩增产物；2)将权利要求1-3中任一所述的引物消化体系加入所述多重扩增产物中进行消化反应，得到消化产物；3)将权利要求1-3中任一所述的接头连接体系加入所述消化产物中进行接头连接反应，得到连接接头产物，即为构建的文库。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述1)中，所述多重扩增体系由PlatinumTaqDNA高保真聚合酶、PhusionUHotStartDNA聚合酶、KAPAHiFiHotStartDNA聚合酶、KAPA2GRobustDNA聚合酶、PfuTurboDNA聚合酶、KODDNA聚合酶和TaKaRaTaqDNA聚合酶中至少一种，2×IonAmpliSeqTMPrimerPool以及1×PCR缓冲体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：王辉，黎一江，郭弘妍，邢婉丽，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11