用于控制鞘翅目害虫和半翅目害虫的SHIBIRE/发动蛋白核酸分子制造技术

本公开涉及核酸分子和使用所述核酸分子控制昆虫害虫的方法，所述方法通过对包括鞘翅目害虫和/或半翅目害虫的昆虫害虫中的靶标编码序列和转录的非编码序列进行RNA干扰介导的抑制来实施。本公开还涉及用于制造表达可用于控制昆虫害虫的核酸分子的转基因植物的方法，以及由此获得的植物细胞和植物。

SHHIBIRE/MOLECULAR MOLECULES FOR CONTROLLING COLEOPTERA AND HEMIPTERA PESTS

The present disclosure relates to nucleic acid molecules and methods for controlling insect pests using the nucleic acid molecules, which are implemented by RNA interference-mediated suppression of target coding sequences and transcriptional non-coding sequences in insect pests including coleoptera pests and/or Hemiptera pests. The present disclosure also relates to methods for producing genetically modified plants expressing nucleic acid molecules that can be used to control insect pests, as well as plant cells and plants obtained therefrom.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于控制鞘翅目害虫和半翅目害虫的SHIBIRE/发动蛋白核酸分子优先权声明本申请要求2015年9月25日提交的美国临时专利申请序列号62/233,061“SHIBIRE/DYNAMINNUCLEICACIDMOLECULESTOCONTROLCOLEOPTERANANDHEMIPTERANPESTS”的提交日的权益，该临时申请全文并入本文。根据37C.F.R§1.821(c)或(e)的声明–作为文本文件提交的序列表根据37C.F.R.§1.821(c)或(e)，包含序列表的TXT版本的文件已与本申请一起提交，其内容据此以引用方式并入。
本专利技术整体涉及由昆虫害虫(例如鞘翅目害虫和半翅目害虫)引起的植物损坏的控制。在特定的实施方案中，本专利技术涉及鉴定靶标编码多核苷酸和非编码多核苷酸，以及使用重组DNA和RNA技术转录后阻遏或抑制靶标编码多核苷酸和非编码多核苷酸在昆虫害虫细胞中的表达，从而提供植物保护效果。
技术介绍
西方玉米根虫(WCR)(玉米根萤叶甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte))是北美最具破坏性的玉米根虫物种之一，在美国中西部玉米种植区备受关注。北方玉米根虫(NCR)(巴氏根萤叶甲(DiabroticabarberiSmithandLawrence))是与WCR在几乎相同的范围内共栖的近缘物种。还有另外几种叶甲属(Diabrotica)的相关亚种是美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(MCR)(墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgiferazeaeKrysanandSmith))；南方玉米根虫(SCR)(十一星根萤叶甲(D.undecimpunctatahowardiBarber))；黄瓜条根萤叶甲(D.balteataLeConte)；黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctatatenella)；南美叶甲(D.speciosaGermar)；以及D.u.undecimpunctataMannerheim。美国农业部已估计玉米根虫每年造成10亿美元收益损失，包括8亿美元的产量损失和2亿美元的治理成本。WCR和NCR均在夏季期间以卵的形式沉积于土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵期。卵为椭圆形、白色，且长度小于0.004英寸。幼虫在五月底或六月初孵出，卵孵出的精确时间由于温度差异和位置不同而每年都有所变化。新孵出的幼虫是白色蠕虫，长度小于0.125英寸。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫历经三个幼虫龄期。进食几周后，幼虫蜕皮，进入蛹期。它们在土壤中化蛹，然后在7月和8月以成虫形式从土壤中出现。成体根虫的长度为约0.25英寸。玉米根虫幼虫在玉米和另外几种禾本科物种上完成发育。在黄色狐尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且比起在玉米上饲养的幼虫，成虫的头壳尺寸较小。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-34。WCR成虫以玉米穗丝、花粉和位于暴露的穗尖上的玉米籽为食。如果WCR成虫在玉米生殖组织存在之前出现，则它们可能以叶组织为食，从而减缓植物生长，并且偶尔会杀死寄主植物。然而，一旦有了偏好的穗丝和花粉，成虫便会快速向其转移。NCR成虫还以玉米植物的生殖组织为食，但相比之下很少以玉米叶为食。玉米中大部分的根虫损害由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以纤细的玉米根毛为食，并钻入根尖内。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫进食时常导致根修剪，一直到玉米杆的基部。严重的根损伤妨碍根将水和养分运输到植物中的能力、减缓植物生长，并导致籽粒产生减少，从而时常大幅降低总产量。严重的根损伤还时常导致玉米植物倒伏，这使收获变得更加困难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可导致穗尖处的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。可通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，形成孢子的革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))或其组合来尝试控制玉米根虫。作物轮作的严重缺陷是不必要地限制了农田的用途。此外，一些根虫物种的产卵可能发生在除玉米以外的作物田中或长期滞育，导致多年的卵孵化，从而降低玉米和大豆实施轮作的有效性。化学杀虫剂是最为人们所倚重的用于实现玉米根虫控制的策略。尽管如此，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫损害所致的损失相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、暴雨以及杀虫剂应用不当都可导致玉米根虫控制不充分。此外，连续使用杀虫剂可能选择杀虫剂抗性根虫品种，并且由于其中许多杀虫剂对非靶标物种存在毒性，所以有严重的影响环境之虞。椿象和其他半翅目昆虫(异翅亚目)构成了另一大类重要的农业害虫。已知全世界有椿象的50多个近缘物种引起作物损坏。McPherson&McPherson(2000)StinkbugsofeconomicimportanceinAmericanorthofMexico，CRCPress。半翅目昆虫存在于大量的重要作物中，这些作物包括玉蜀黍、大豆、水果、蔬菜和谷类。椿象在历经多个若虫期后才进入成虫期。这些昆虫在约30至40天内从卵发育为成虫。若虫和成虫均以来自软组织的汁液为食，它们还将消化酶注入软组织中，引起口外组织消化和坏死。然后摄入消化的植物材料和养分。耗尽来自植物维管系统的水和养分造成植物组织损坏。对发育中的籽粒和种子的损害最为显著，因为产量和萌发显著减少。在温暖的气候下会出现多个世代，造成重大的昆虫压力。目前对椿象的管理依赖于在单块田基础上用杀虫剂处理。因此，迫切需要替代性管理策略，来将正在发生的作物损失降至最低限度。欧洲花粉甲虫(PB)是对油菜有严重危害的害虫，幼虫和成虫均以花和花粉为食。花粉甲虫对作物的损害可造成20％至40％的产量损失。主要的害虫物种为油菜露尾甲(Meligethesaeneus)。目前，控制危害油菜的花粉甲虫主要依赖拟除虫菊酯，鉴于这类物质的环境和监管概貌，预料其很快就会遭到淘汰。另外，已报道过花粉甲虫对现有化学杀虫剂的抗性。因此，迫切需要具有新颖作用机制的环境友好型花粉甲虫控制解决方案。在自然界中，花粉甲虫在土壤中或落叶层下以成虫过冬。在春季，成虫从冬眠中出现，并开始以杂草的花朵为食，且迁移到开花的油菜植物上。在油菜花蕾中产卵。幼虫在花蕾中和花朵上取食并发育。后期幼虫在土壤中找到化蛹处所。第二代成虫在七八月出现，并且在找到过冬的处所之前以各种开花植物为食。RNA干扰(RNAi)是一种利用内源性细胞途径的方法，凭借该方法，对整个靶标基因或靶标基因的尺寸足够大的任何部分有特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如dsRNA分子)引起由其编码的mRNA降解。近年来，在许多物种和实验系统例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、植物、昆虫胚胎和组织培养物中的细胞中，已使用RNAi执行基因“敲低”。参见例如Fire等人，(1998)Nature391:806-11；Martinez等人，(2002)Cell110:563-74；McManus和Sharp，(2002)Nat本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经分离的核酸，其包含与异源性启动子可操作地连接的至少一种多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:1；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:1；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:1；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:3；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:5的互补序列；SEQ ID NO:5的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:5的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:5；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补序列；SEQ ID NO:89的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:89的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；美洲蝽属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:89；美洲蝽属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:89；美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:89；以及美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:89。SEQ ID NO:112；SEQ ID NO:112的互补序列；SEQ ID NO:112的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:112的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:112；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:112；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:112；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:112；SEQ ID NO:114；SEQ ID NO:114的互补序列；SEQ ID NO:114的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:114的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:114；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:114；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:114；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:114；SEQ ID NO:116；SEQ ID NO:116的互补序列；SEQ ID NO:116的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:116的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:116；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:116；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:116；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:116；SEQ ID NO:118；SEQ ID NO:118的互补序列；SEQ ID NO:118的至少15...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.25 US 62/233,0611.一种经分离的核酸，其包含与异源性启动子可操作地连接的至少一种多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的互补序列；SEQIDNO:1的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:1；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:1；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:1；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:1；SEQIDNO:3；SEQIDNO:3的互补序列；SEQIDNO:3的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:3的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:3；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:3；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:3；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:3；SEQIDNO:5；SEQIDNO:5的互补序列；SEQIDNO:5的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:5的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:5；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:5；SEQIDNO:89；SEQIDNO:89的互补序列；SEQIDNO:89的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:89的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；美洲蝽属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:89；美洲蝽属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:89；美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:89；以及美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:89。SEQIDNO:112；SEQIDNO:112的互补序列；SEQIDNO:112的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:112的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:112；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:112；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:112；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:112；SEQIDNO:114；SEQIDNO:114的互补序列；SEQIDNO:114的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:114的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:114；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:114；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:114；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:114；SEQIDNO:116；SEQIDNO:116的互补序列；SEQIDNO:116的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:116的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:116；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:116；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:116；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:116；SEQIDNO:118；SEQIDNO:118的互补序列；SEQIDNO:118的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:118的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:118；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:118；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:118；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:118；SEQIDNO:120；SEQIDNO:120的互补序列；SEQIDNO:120的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQIDNO:120的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；露尾甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:120；露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:120；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:120；露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:120；2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120，以及前述中任一者的互补序列。3.一种植物转化载体，其包含权利要求1所述的多核苷酸。4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述生物体选自：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、十一星根萤叶甲、墨西哥玉米根萤叶甲、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、D.u.undecimpunctataMannerheim、南美叶甲、油菜露尾甲(花粉甲虫)、英雄美洲蝽(新热带区棕椿象)、稻绿蝽(南方绿椿象)、盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅蝽)、Chinaviahilare(Say)(绿椿象)、褐臭蝽(棕椿象)、椿虫(Dallas)、Dichelopsfurcatus(F.)、Edessameditabunda(F.)、Thyantaperditor(F.)(新热带区红肩椿象)、Chinaviamarginatum(PalisotdeBeauvois)、Horciasnobilellus(Berg)(棉花臭虫)、Taediastigmosa(Berg)、秘鲁棉红蝽、Neomegalotomusparvus(Westwood)、Leptoglossuszonatus(Dallas)、Niesthreasidae(F.)、豆荚草盲蝽(西部牧草盲蝽)以及美国牧草盲蝽。5.一种核糖核酸(RNA)分子，其从权利要求1所述的多核苷酸转录。6.一种双链核糖核酸分子，其由权利要求1所述的多核苷酸表达而产生。7.根据权利要求6所述的双链核糖核酸分子，其中所述多核苷酸序列与鞘翅目或半翅目害虫的接触抑制与所述多核苷酸特异性互补的内源性核苷酸序列的表达。8.根据权利要求7所述的双链核糖核酸分子，其中所述核糖核苷酸分子与鞘翅目或半翅目害虫的接触杀死所述害虫，或者抑制所述害虫的生长和/或进食。9.根据权利要求6所述的双链RNA，其包含第一RNA区段、第二RNA区段和第三RNA区段，其中所述第一RNA区段包含所述多核苷酸，其中所述第三RNA区段通过第二多核苷酸序列连接到所述第一RNA区段，并且其中所述第三RNA区段基本上为所述第一RNA区段的反向互补序列，使得所述第一RNA区段和所述第三RNA区段在转录成核糖核酸时杂交而形成所述双链RNA。10.根据权利要求5所述的RNA，其选自：长度介于约15个核苷酸和约30个核苷酸之间的双链核糖核酸分子和单链核糖核酸分子。11.一种植物转化载体，其包含权利要求1所述的多核苷酸，其中所述异源性启动子在植物细胞中具有功能。12.一种细胞，其用权利要求1所述的多核苷酸转化。13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞为原核细胞。14.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞为真核细胞。15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述细胞为植物细胞。16.一种植物，其用权利要求1所述的多核苷酸转化。17.根据权利要求16所述的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。18.一种由权利要求16所述的植物产生的商品产品，其中所述商品产品包含可检出量的所述多核苷酸。19.根据权利要求16所述的植物，其中所述至少一种多核苷酸在所述植物中表达为双链核糖核酸分子。20.根据权利要求15所述的细胞，其中所述细胞为玉米、大豆或欧洲油菜细胞。21.根据权利要求16所述的植物，其中所述植物为玉米、大豆或欧洲油菜。22.根据权利要求16所述的植物，其中所述至少一种多核苷酸在所述植物中表达为核糖核酸分子，并且当鞘翅目或半翅目害虫摄入所述植物的一部分时，所述核糖核酸分子抑制与所述至少一种多核苷酸特异性互补的内源性多核苷酸的表达。23.根据权利要求1所述的多核苷酸，...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·纳瓦，S·E·沃尔登，M·弗雷，M·朗戈萨米，K·阿罗拉，B·维拉曼尼，P·甘德拉，E·菲什里维奇，C·耿，A·威尔鑫斯卡斯，E·克诺尔，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，弗劳恩霍夫应用研究促进协会，
类型：发明
国别省市：美国,US