新城疫病毒基质蛋白的抗原表位、抗体、鉴定方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新城疫病毒基质(Matrix，M)蛋白的抗原表位、抗体、鉴定方法和应用，涉及生物学技术领域。本发明专利技术提供的新城疫病毒基质蛋白的抗原表位的序列1为

【技术实现步骤摘要】
新城疫病毒基质蛋白的抗原表位、抗体、鉴定方法和应用
本专利技术涉及生物学
，尤其涉及一种新城疫病毒基质蛋白的抗原表位、抗体、鉴定方法和应用。
技术介绍
新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)引起的一种禽类呼吸道、消化道和神经系统损伤为主要特征的急性、高度致死性传染病。NDV为单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科禽副黏病毒属。NDV基因组全长约为15.2kb，与其它副黏病毒相似，其基因编码包括核蛋白(nucleoprotein，NP)，磷蛋白(phosphoprotein，P)，基质蛋白(matrixprotein，M)，融合蛋白(fusionprotein,F)，血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-nueraminidase，HN)和大聚合酶蛋白(RNA-dependentRNApolymeraseorlargeploymerase，L)在内的6个蛋白，基因组以3’-NP-P-M-F-HN-L-5’顺序排列。其中，M基因核苷酸长度为1241bp，开放性阅读框长度为1095bp，共编码364个氨基酸，蛋白分子量约为40kDa。它是NDV的非糖基化膜相关蛋白，在病毒的装配、出芽过程中发挥重要作用。其作为非保护性抗原在表达量上非常丰富且高度保守，能够诱导动物产生高滴度的抗体。NDV只有一个血清型，准确的M蛋白抗原表位可以作为生物学标记为新城疫相关的诊断及标记疫苗的研发奠定基础，但目前相关技术公开较少。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种新城疫病毒基质蛋白的抗原表位、抗体、鉴定方法和应用，主要目的是鉴定新城疫病毒M蛋白B细胞的抗原表位。为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种新城疫病毒基质蛋白的抗原表位，所述基质蛋白的B细胞优势线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQIDNO.1(77MIDDKP82)和SEQIDNO.2(354HTLAKYNPFK363)。作为优选，所述新城疫病毒的毒株类型包括ClassII系中II型(LaSota株)、VI型(SX10株)、VII型(JS株)、IX型(F48E9)以及ClassI系(pigeon/QH株)。另一方面，本专利技术实施例提供了上述新城疫病毒基质蛋白的抗原表位的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：利用B细胞线性表位分析软件，结合蛋白质二级结构预测以及亲水性方案、突出表面及转角方案、表面可及性方案、灵活性方案、极性方案、抗原性方案分析新城疫疫苗株的M蛋白B细胞潜在的线性表位分布，为后续表位鉴定提供参考；步骤2：在不破坏步骤1获得的M蛋白优势线性表位预测区域的前提下，将M蛋白分为M1和M2两段，通过Westernblot和IFA检测M蛋白全长和分段区域蛋白抗原性情况；步骤3：对疫苗株免疫的鸡抗血清靶向其M蛋白重叠肽段进行肽扫描分析，根据抗原-抗体结合强度信号初步确定M蛋白的线性表位区域；将肽扫描得到的表位序列融合红色荧光蛋白进行表达，通过Westernblot和IFA进行检测，初步确定准确的抗原表位区域；根据鉴定结果，将反应阳性的表位序列进行人工合成，得到合成肽，对所述合成肽进行Dot-blot和ELISA检测；步骤4：利用步骤3的所述合成肽免疫小鼠制备抗血清；利用Dot-blot检测所述合成肽和所述抗血清之间的反应以及交叉反应情况；利用制备的鼠抗合成肽血清和疫苗株全病毒进行反应检测筛选表位序列；步骤5：对筛选出的所述表位序列进行连续定点突变，然后和步骤4制备的小鼠抗血清进行分析验证，确定出最短优势表位序列，所述最短优势表位序列为权利要求1所述的序列1和序列2；步骤6：将鉴定出的疫苗株M蛋白B细胞线性抗原表位区域的氨基酸序列和新城疫病毒其他所有基因型代表毒株M蛋白对应区域进行比对分析，确定其保守性；将步骤4制备的鼠抗血清和其他病毒反应，以确定鉴定出的抗原表位区域是否适用于其他病毒毒株。作为优选，所述步骤1中的新城疫疫苗株类型为ClassII系中II型(LaSota株)；所述步骤6中的新城疫病毒其他所有基因型代表毒株类型为VI型(SX10株)、VII型(JS株)、IX型(F48E9)以及ClassI系(pigeon/QH株)。又一方面，本专利技术实施例提供了上述新城疫病毒抗体，所述抗体是采用上述的抗原表位序列偶联惰性蛋白，按照免疫程序免疫动物获得的抗血清，所述抗性血清即为所述新城疫病毒的抗体。再一方面，本专利技术实施例提供了上述新城疫病毒抗体和抗原的鉴别方法，所述鉴别方法包括采用上述抗原表位序列作为抗原去检测新城疫病毒抗体；采用上述制备的抗体检测新城疫病毒。又一方面，新城疫病毒疫苗，所述疫苗包括上述新城疫病毒基质蛋白的抗原表位经过包括缺失或插入修饰构建的标记疫苗。又一方面，本专利技术实施例提供了上述新城疫病毒基质蛋白的抗原表位在制备新城疫病毒抗体中的应用。又一方面，本专利技术实施例提供了上述新城疫病毒基质蛋白的抗原表位在制备新城疫病毒疫苗中的应用。又一方面，本专利技术实施例提供了上述新城疫病毒基质蛋白的抗原表位在鉴定新城疫病毒抗原和抗体中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术提供了2个新城疫病毒M蛋白的B细胞优势线性表位，详细的序列为：77MIDDKP82和354HTLAKYNPFK363；2.本专利技术提供的2个新城疫病毒M蛋白B细胞表位可用于新城疫病毒血清学分析的检测抗原；3.本专利技术筛选出的2个M蛋白B细胞优势表位可以作为标记去构建新城疫病毒的标记疫苗；4.本专利技术通过不同基因型序列比对分析，提供了2个M蛋白的B细胞优势线性表位序列在新城疫病毒所有基因型的M蛋白中具有较高的保守性，其M蛋白的表位区域77-82和354-363可适用于所有的新城疫病毒毒株；例如ClassII系中II型(LaSota株)、VI型(SX10株)、VII型(JS株)、IX型(F48E9)以及ClassI系(pigeon/QH株)；5.本专利技术综合利用信息生物学，肽扫描技术和定点突变技术对M蛋白的B细胞线性表位进行了精确定位；该鉴定系统简便，准确，可以为其它病毒蛋白的抗原表位鉴定提供参考。附图说明图1A是本专利技术实施例提供的M蛋白二级结构预测结果图；图1B是本专利技术实施例提供的M蛋白抗原表位预测结果图；图2是本专利技术实施例提供的M蛋白及其分段产物与LaSota疫苗毒株免疫鸡抗血清的反应结果图；(A：M蛋白以及分段真核表达产物的Westernblot检测；B：M蛋白以及分段真核表达产物的IFA检测)；图3是本专利技术实施例提供的M蛋白与鸡抗血清的肽扫描信号结果图；图4是本专利技术实施例提供的优势抗原表位序列融合RFP表达的鉴定结果图；(A：优势抗原表位RFP融合蛋白的IFA检测；B：优势抗原表位RFP融合蛋白的Westernblot检测)；图5是本专利技术实施例提供的优势抗原表位合成肽与鸡抗血清的反应性结果图；(A：利用dot-blot检测合成肽和LaSota鸡阳性血清反应情况；B：MIDE2和MIDE6合成肽与鸡抗血清反应敏感性试验；C：ELISA检测合成肽和鸡阳性抗血清反应情况)；图6是本专利技术实施例提供的优势表位合成肽与其小鼠抗血清的反应情况图；图7是本专利技术实施例提供的优势抗原MI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新城疫病毒基质蛋白的抗原表位，其特征在于，所述基质蛋白的B细胞优势线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.新城疫病毒基质蛋白的抗原表位，其特征在于，所述基质蛋白的B细胞优势线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。2.如权利要求1所述的新城疫病毒基质蛋白的抗原表位，其特征在于，所述新城疫病毒的毒株类型包括ClassII系中II型(LaSota株)、VI型(SX10株)、VII型(JS株)、IX型(F48E9)以及ClassI系(pigeon/QH株)。3.新城疫病毒基质蛋白的抗原表位的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：利用B细胞线性表位分析软件，结合蛋白质二级结构预测以及亲水性方案、突出表面及转角方案、表面可及性方案、灵活性方案、极性方案、抗原性方案分析新城疫疫苗株的M蛋白B细胞潜在的线性表位分布，为后续表位鉴定提供参考；步骤2：在不破坏步骤1获得的M蛋白优势线性表位预测区域的前提下，将M蛋白分为M1和M2两段，通过Westernblot和IFA检测M蛋白全长和分段区域蛋白抗原性情况；步骤3：对疫苗株免疫的鸡抗血清靶向其M蛋白重叠肽段进行肽扫描分析，根据抗原-抗体结合强度信号初步确定M蛋白的线性表位区域；将肽扫描得到的表位序列融合红色荧光蛋白进行表达，通过Westernblot和IFA进行检测，初步确定准确的抗原表位区域；根据鉴定结果，将反应阳性的表位序列进行人工合成，得到合成肽，对所述合成肽进行Dot-blot和ELISA检测；步骤4：利用步骤3的所述合成肽免疫小鼠制备抗血清；利用Dot-blot检测所述合成肽和所述抗血清之间的反应以及交叉反应情况；利用制备的鼠抗合成肽血清和疫苗株全病毒进行反应检测筛选表位序列；步骤5：对...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧飒，毕友坤，杨增岐，陈鸿军，王文彬，金忠元，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61