一种表达高酶活淀粉酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种表达高酶活淀粉酶的方法，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。本发明专利技术通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AodevR的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第2天，AodevR敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的3倍，并且在第5天增加至参照株的7倍。

【技术实现步骤摘要】
一种表达高酶活淀粉酶的方法
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种表达高酶活淀粉酶的方法。
技术介绍
淀粉是自然界最丰富的原料之一，是人类食物的重要成分，在食品领域有着广泛的用途。淀粉很容易从植物中获得，价格低廉，淀粉在工业上的应用，是缓解环境污染，实现人类可持续发展的关键。淀粉利用的关键是把淀粉降解为可发酵的糖类-葡萄糖。淀粉酶能将未经蒸煮的生淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂。根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生物制剂等多种领域。获得高产淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生产成本成为淀粉酶工业化利用的必由之路。选育优良的菌株是酶制剂产业的核心问题。用传统的菌种生产酶制剂往往存在着产量低、工艺复杂、成本高等缺点。采用工程菌高效表达酶蛋白，是降低酶制剂生产成本、创制新型酶制剂的有效途径，也是该领域的竞争焦点。发展安全、通用、高效、规模化表达系统，是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地，对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。米曲霉具有卓越的表达和分泌酶蛋白的能力、安全性较高、遗传背景清晰，被认为是生产淀粉酶最有应用前景的菌株之一。构建高产淀粉酶的菌株，成为米曲霉生产淀粉酶工业化利用的途径之一。构建淀粉酶高产的菌株有用物理诱变、化学诱变、基因工程构建基因工程菌株等。用物理诱变和化学诱变的方法具有快捷有效的特点，但是诱变是一个随机的过程，缺乏方向性。基因工程构建菌株就有可操控的方向性，已经成为构建高产菌株的主要手段。基因敲除，能打破已有的代谢网络，代谢网络的改变，有利于获得更高产量的菌株。米曲霉中淀粉酶转录激活因子AmyR在淀粉或麦芽糖的诱导下会激活下游淀粉酶的表达，而CreA和CreB参与调控淀粉酶转录因子AmyR的表达。米曲霉淀粉酶生产的瓶颈在于：在米曲霉培养后期存在着反抑制调控，其会抑制米曲霉淀粉酶的生产，虽然这方面有研究通过删除单creA和双creA/creB基因片段，一定程度上提高了在高浓度培养后期的淀粉酶活性，但效果不是很明显。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种表达高酶活淀粉酶的方法，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种表达高酶活淀粉酶的方法，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。所述的表达高酶活淀粉酶的方法，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AodevR敲除。所述的表达高酶活淀粉酶的方法，具体步骤如下：1)利用PrimeStarPCR聚合酶扩增AodevR基因两侧片段和pyrG基因；并电泳检测确定扩增成功；2)纯化电泳凝胶中DNA，获得AodevR基因两侧片段与pyrG基因片段；3)将AodevR基因两侧片段与pyrG基因融合，并电泳确认融合成功；4)将融合基因转化入E-F1菌株，利用选择性培养基(CD)进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行Southernblot鉴定；5)培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。步骤1)中，AodevR基因两侧片段为：AodevRL，基因序列如SEQIDNO.1所示；AodevRR，基因序列如SEQIDNO.2所示；pyrG基因的序列如SEQIDNO.3所示)。步骤1)中，PCR体系：25μL的primestarMix酶；上游引物、下游引物各2μL；1μLA.oryzaeRIB40基因组DNA；加入水至50μL；具体引物序列见下表：步骤1)中，PCR条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。步骤3)中，利用fusionPCR进行融合，基因加入摩尔浓度比：AodevRL∶pyrG∶AodevRR＝1∶3∶1。步骤3)中，PCR体系：primestarMix25μL；上游引物，下游引物各加2μL；按浓度比加入模板；加水定容至50μL。步骤3)中，两步法：98.0℃10s；98.0℃10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存；三步法：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；n；16.0℃保存。步骤4)中，转化过程如下：Solution1，使用0.45μm过滤灭菌到新的50mL灭菌tube中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入1中配置的Solution0+1中，用封条裹上tube，30℃50rpm3h；制冰；过滤，取液体；加Solution210mL，上下混合；将tube取出在4℃下离心2000rpm8min，取沉淀；加5mLSolution2混匀4℃下离心2000rpm8min上清液丢弃；视沉淀量加Solution2，分装各200μL×4；分别加10μL质粒，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将CD选择培养基放微波炉溶后，倒入50mL的tub中，放45℃中保温；30min后分3次加入Solution3：250μL混匀；250μL混匀；850μL混匀。在室温中放置20min；加入5mLSolution2混匀后4℃下离心2000rpm8min将上清液丢弃；加入500μLSolution2混匀，加入10mLCD上层培养基混匀后倒平板；在CD培养基30℃环境下3-5天避光培养。有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AodevR的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第2天，AodevR敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的3倍，并且在第5天增加至参照株的7倍。附图说明图1是AodevR基因敲除原理图；图2是基因片段电泳图；图3是融合基因电泳图；图4是southernblot验证结果图；图5是米曲霉淀粉酶酶活性测定图；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1一种表达高酶活淀粉酶的方法，流程图如图1所示，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，图中标出的SmaI酶切位点及probe探针位置用于Southemblot验证。具体步骤如下：1)利用PrimeStarPCR聚合酶(TaKaRa，Japan)扩增AodevR基因两侧片段(AodevRL，基因序列如SEQIDNO.1所示；AodevRR，基因序列如SEQIDNO.2所示)和pyrG基因(基因序列如SEQIDNO.3所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。

【技术特征摘要】
2018.05.18 CN 20181047701551.一种表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。2.根据权利要求1所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AodevR敲除。3.根据权利要求1或2所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)利用PrimeStarPCR聚合酶扩增AodevR基因两侧片段和pyrG基因；并电泳检测确定扩增成功；2)纯化电泳凝胶中DNA，获得AodevR基因两侧片段与pyrG基因片段；3)将AodevR基因两侧片段与pyrG基因融合，并电泳确认融合成功；4)将融合基因转化入E-F1菌株，利用选择性培养基(CD)进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行Southernblot鉴定；5)培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。4.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤1)中，AodevR基因两侧片段为：AodevRL，基因序列如SEQIDNO.1所示；AodevRR，基因序列如SEQIDNO.2所示；pyrG基因的序列如SEQIDNO.3所示)。5.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR体系：25μL的primestarMix酶；上游引物、下游引物各2μL；1μLA.oryzaeRIB40基因组DNA；加入水至50μL；具体引物序列见下表：6.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。7.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤3...

【专利技术属性】
技术研发人员：金锋杰，庄淼，张智敏，王宝腾，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32