一种基于核磁共振技术提高黑曲霉a-葡萄糖苷酶活力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高黑曲霉α‑葡萄糖苷酶活力的方法，属于生物工程领域。本发明专利技术通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉生产α‑葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α‑葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α‑葡萄糖苷酶的酶活力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于核磁共振技术提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种提高真菌产酶的方法，特别是一种基于核磁共振技术来筛选真菌重要代谢物并以此调整发酵条件以达到有效提高真菌产酶活力的方法。
技术介绍
低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide，IMO)是一类功能性寡聚糖，具有重要的生理功能，如促进肠道有益菌增殖、降低血脂；提高抗龋齿性，作为病人的保健甜味剂。其他作用包括农作物增产促进剂、抗病毒和真菌临床治疗剂、化学合成间体等。目前利用酶法合成低聚异麦芽糖产量仍旧是供不应求。获得低聚异麦芽糖的方法主要有糖化酶的逆催化作用和α-葡萄糖苷酶的转苷作用。利用糖化酶的逆催化作用是在高浓度的葡萄糖溶液中发生逆转催化，将葡萄糖缩合为低聚异麦芽糖，但此过程低聚糖产量低，不到35％，且生成产物复杂周期长故不适合工业化生产。利用α-葡萄糖苷酶的转苷作用以麦芽糖为底物水解成两分子葡萄糖，释放出葡萄糖残基被以α-1,6糖苷键连接到另一葡萄糖分子而形成异麦芽糖，继续进行转苷作用生成低聚异麦芽糖，此生产工艺相对成熟，应用较广。目前国外α-葡萄糖苷酶已实现工业化生产，其最高酶活力达到30U/mL活力单位(以甲基-α-葡萄糖苷苷为底物，每分钟生成1μmol的葡萄糖的酶量为标准活力单位U)，而国内α-葡萄糖苷酶产品均为国外少数几个大的酶制剂厂生产。定量核磁共振技术是一种可以通过准确定量代谢物的绝对浓度值来获得物质内部信息的一项技术。现有技术中有利用核磁共振技术制备样品快速方便无损的优点分析不同地区姜黄属的次级代谢产物差异，及从番泄叶根部分离出的镰刀菌的筛选出不同于人工培养条件下的毒素产物。同时利用该技术检测植物在感染病菌会引发的一系列代谢物变化，了解植物防御的自然机制从而来设计基因改良型提高其抗病性等。本专利技术所要解决的技术问题提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶的活力，旨在解决传统培养基优化方式中存在的耗时长成本高的问题，采用基于核磁共振技术对代谢物的相对定量，快速筛选到真菌胞内差异代谢物。该技术前处理简便快速，实现对真菌产酶过程中的各代谢物全面分析。结合统计学分析法，找出影响目标酶活的重要前体物质，并通过后期前体物质的外源添加以提高目标酶活。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于核磁共振技术判别黑曲霉产酶过程的重要代谢物，并通过代谢组学来筛选提高黑曲霉的α-葡萄糖苷酶活力的前体物质，从而提高黑曲霉的α-葡萄糖苷酶活力。本专利技术提供了一种提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法，通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的酶活力。其中，所述一种或多种代谢物包括：葡萄糖、海藻糖、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙醇、醋酸盐，肌酸、胆碱、甜菜碱。本专利技术所述提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法包括以下步骤：1)制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品；2)对待测样品进行1HNMR分析，获得所述黑曲霉菌体的核磁共振分析谱图；3)以2，2，3，3-四甲基甲硅烷基丙酸为内标，采用分段积分方法，根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量；4)通过比较获得影响黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物。进一步地，所述根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量包括利用TOPSPIN3.5对1HNMR谱图进行相位及基线矫正，经MestReNova12.0.1进行分段积分后再导入SIMCA-P13.0进行多元数据分析处理。进一步地，本专利技术还公开了所述方法在提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力中的应用。附图说明图1是galA1-NR和NR-galA2片段的质粒提取。其中M：DL10,000bpmaker1：galA1-NR质粒2：NR-galA2质粒。图2是菌落PCR挑取重新转化的5个单菌落转化子进行PCR验证。其中M：250bpmaker1：阳性转化子2-5：假性转化子。图3是galA1-NR和NR-galA2表达盒的扩增。其中M：250bpmaker1：galA1-NR(2,693bp)2：NR-galA2(2,797bp)。图4是黑曲霉转化子两个片段Ver-1和Ver-2的1％琼脂糖凝胶电泳条带。其中1，2：第一个转化子Ver-1和Ver-2；3，4：第二个转化子Ver-1和Ver-25，6：第三个转化子Ver-1和Ver-2；7，8：阴性对照Ver-1和Ver-2。图5中(a)：黑曲霉HE01和ΔgalA的菌体干重变化曲线；(b)：α-葡萄糖苷酶酶活变化；(c)：糖化酶酶活变化。图6是600MHz1HNMR谱图化合物指认。其中，δH8.5～5.0ppm虚线框放大了4倍。图7是OPLS-DA分析黑曲霉HE01和ΔgalA的代谢物。其中，每一个点代表一个样品。具体实施方式【实施例1】黑曲霉galA缺失突变株的构建以下通过具体的实施例进一步对本专利技术进行说明，不能理解为是对本专利技术的限制，实施例中使用的菌株、材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术中使用的黑曲霉HE01是生产糖化酶的工业菌株，来源于湖北立业公司，E.coliTop10F购自Invitrogen公司，诺尔丝菌素购自北京索宝来科技公司。本实施例使用的主要仪器：超净工作台，SW-CJ-1FD，苏净安泰；全自动高压灭菌锅，HVE-50，Hirayama；PCR扩增仪，2720，ABI；琼脂糖凝胶电泳仪，POWER/PAC300，Bio-Rad；凝胶成像系统，UniversalHoodII，Bio-RAD；低温培养箱，LTI-700，EYELA；振荡摇床，SKY-200B，SUKUN；酶标仪，MODEL550，Bio-RAD。本实施例使用的菌株和质粒如下表1：菌株和质粒特征或遗传性状SourceHE01高产糖化酶湖北立业公司惠赠E.coliTop10FgalA1-NR、NR-galA2片段本专利技术购建，用于研究目的可向公众公开pGEMT-Vector氨苄青霉素抗性(AmpR)购自Promega培养基及溶液配制察氏培养基(g/L)：蔗糖30g，NaNO32g，K2HPO41g，MgSO40.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，固体加琼脂17g，半液体加琼脂0.5g。121℃，20min灭菌。LB培养基(g/L)：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，固体添加琼脂15g。121℃，20min灭菌。原生质体再生培养基：1×STC50mL，10×葡萄糖10mL，察氏培养基40mL，单独配制，121℃，20min灭菌后再混合。1×STC溶液()：山梨醇216.80g，1MTris-HCl(pH7.5-8.0)10mL，1MCaCl2100mL，加去离子水定容至1L。60％PEG4000：1MTris-HCl(pH7.5)10mL，1MCaCl250mL，PEG4000600g，加去离子水定容至1L。本实施例所用引物序列如下表2所示：菌体培养及保种：(1)大肠杆菌复苏培养与保种取-80℃超低温冰箱保存的菌种置于冰盒上缓慢解冻待溶解后用枪头吸取少量菌液在平板上划线，37℃恒温培养过夜。进行敲除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高黑曲霉α‑葡萄糖苷酶活力的方法，其特征在于，通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉α‑葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α‑葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α‑葡萄糖苷酶的酶活力。

【技术特征摘要】
1.一种提高黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的方法，其特征在于，通过核磁共振技术来筛选影响黑曲霉α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物，建立所述代谢物与黑曲霉α-葡萄糖苷酶活力的关联，以此调节黑曲霉的发酵培养液成分以提高黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的酶活力。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种代谢物包括：葡萄糖、海藻糖、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙醇、醋酸盐、肌酸、胆碱、甜菜碱。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品；2)对待测样品进行1HNMR分析，获得所述黑曲霉菌体的核磁共振分析谱图；3)以2，2，3，3-四甲基甲硅烷基丙酸为内标，采用分段积分方法，根据步骤2中的分析图谱获得黑曲霉胞内一种或多种代谢物的相对含量；4)通过比较获得影响黑曲霉生产α-葡萄糖苷酶的一种或多种代谢物。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述制备用于核磁共振测试的黑曲霉待测液样品的步骤为：取待...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓帆，周慧，余少文，胡萍，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44