带电质量标记系统技术方案

本发明专利技术大体上涉及带电质量标记组合物及其用于检测样品中的靶标分析物的使用方法。在某些方面，本发明专利技术提供带电质量标记组合物，其包括亲和试剂以及与亲和试剂结合的质量标记前体。质量标记前体包括标记结合单元和质量标记。标记结合单元可逆地将质量标记与亲和试剂结合。质量标记包括电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】带电质量标记系统相关申请本申请要求2016年1月22日提交的美国临时专利申请序列号62/286,115的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。
本专利技术大体上涉及带电质量标记组合物及其用于检测样品中的靶标分析物的使用方法。
技术介绍
已经开发了一些测定法，其重点在于从体液中分析稀有分子(例如蛋白质，核酸等)是否存在异常，从而导致某些病况如癌症的早期诊断。然而，在典型的体液样品中，大多数稀有分子被降解，并且相对于样品中分子的总量，任何含有所关注的异常的改变的稀有分子以少量(例如，小于1％)存在。这导致无法检测到少量异常稀有分子。已经开发了亲和力测定法、核酸测定法和细胞分析测定法用于检测样品中的稀有分子。每个都有一些缺点。例如，通过常规亲和力测定法无法检测到每毫升1至50,000个拷贝(飞摩尔(fM)或更低)的稀有分子，常规亲和力测定法需要远远超过稀有分子数量的分子拷贝数。免疫测定法受抗体的亲和力结合常数的限制，所述亲和力结合常数通常不高于10-12(1pM)。由于解离速率为10-13，所以免疫测定法需要至少100倍的抗体过量，并且抗体蛋白的溶解度限制了反应的完成。针对核酸，先前已经采用基于扩增的方法(例如，聚合酶链式反应(PCR)、数字PCR、定量PCR)来试图检测这些异常。然而，由于扩增反应的随机性质，所以通常忽略样品中少量存在的分子群。事实上，如果稀有核酸在前几轮扩增中没有被扩增，那么稀有物种将越来越不可能被检测到。在稀有分子被细胞结合或包含在细胞内的情况下，采用细胞分析技术，需要分离包含稀有分子的靶细胞。包含稀有分子的那些细胞通常仅代表分析中的一小部分样品。因此，即使在检测这些细胞内的稀有分子之前，也需要具有高分离效率和细胞回收率的方法。纯化后，可以通过常规扫描显微镜将稀有细胞分析至单细胞水平。然而，即使扫描和分析自动化，对于每个待扫描的样品，显微镜方法可能需要24小时或更长时间。另外，所有具有多个图像的稀有细胞必须由病理学家目测检查以确定测量的蛋白质量的显著性。已经尝试使用质谱法(MS)进行稀有事件检测。但是，出现了一些问题。例如，不能将所关注的标记与样品干扰(矩阵重叠)分开。由于临床样品中的背景而导致的更高检测极限(皮摩尔(pM)增加至纳摩尔(nM))是一个问题。由于小于1微升(jal)的样品被低效捕获用于电离并且从复杂样品例如血液中低效地分离，因此无法使用小的nL样品体积。此外，由于与相同质量的其它离子竞争电离或由于特定基质组分的存在而抑制电离，所以MS通常不能检测到某些质量。这些问题通常会由于假阳性和/或假阴性结果而导致问题。为了解决这些问题，已经开发了依赖于使用与样品中的稀有分子结合的质量标记的技术。该方法允许质谱法用于稀有事件检测，因为使用质量标记克服了与直接检测样品中的稀有分子相关的上述问题。然而，质量标记仍然存在问题，其限制了质谱法用于稀有分子检测的全部潜力。例如，目前的MS标记通常利用通过可逆二硫键与亲和剂结合的肽。然而，肽倾向于在质谱仪中容易地交换质子并且通常具有低电离效率。另外，用于从二硫键释放肽的化学物质，例如TCEP和DTT，可能抑制来自质量标记的质谱中的信号强度。虽然强酸例如TFA可以提高电离效率，但它们防止TCEP和DTT裂解二硫键，因此需要单独的液体来通过喷雾电离释放和电离质量标记。因此，质量标记技术的应用仍然存在问题；即，质量标记例如肽不具有理想的电离效率，当前质量标记可能不会碎裂成可与背景噪声分离的可预测质量，并且质量标记不容易从亲和试剂上裂解下来。
技术实现思路
本专利技术大体上涉及带电质量标记组合物，其设计成与样品的背景质量分析分离并且高效电离。本专利技术的组合物包括亲和试剂和与亲和试剂结合的质量标记前体。由于亲和试剂的特异性，每个MS标记可以对应于来自样品的一种或多种靶标稀有分子。多级MS(也称为MSn、CID)可用于检测样品中不同的稀有分子群。将结合的亲和剂暴露于物质以化学释放MS标记用于MS分析，从而确定每种不同MS标记的存在和/或量。每种不同MS标记的存在和/或量与样品中每种不同稀有分子群的存在和/或量有关。质量标记前体包括标记结合单元和质量标记。标记结合单元可逆地将质量标记与亲和试剂结合。标记结合单元的可逆结合允许从亲和剂中容易且可靠地裂解MS标记。质量标记包括电荷单元(例如，预带电的(离子官能团)，例如季铵(季胺)基团，或类似的锍或鏻阳离子，或吡啶鎓或咪唑鎓)。这种电荷单元是离子型，因此在MS中很容易观察为气相离子。质量标记还包括质量标记单元，其在质谱中具有预定义的质荷比值。质量标记可以由于电离时的碎裂产生至少一个独特的质量碎片，并且经过MS/MS成为与背景分离的至少一个可预测的m/z。因为质量标记产生了与背景分离的可预测的m/z，所以通过质谱法可以容易地检测特征质量标记。许多不同类型的亲和试剂可用于本专利技术的组合物中。在某些实施例中，亲和试剂包括特异性结合对的至少一个成员。亲和试剂可以是非颗粒状或颗粒状的，并且与质谱(MS)标记前体连接，从中可以释放包含MS标记的实体。在某些实施例中，质量标记单元和电荷单元通过一个或多个在电离时抗断裂的键彼此结合。通常，标记结合单元包括可逆键，例如缩醛或缩酮键。电荷单元包括一个或多个化学部分，其被布置成在电离时具有电荷。例如，电荷单元可包括一个或多个选自由式I-VII组成的组的化学部分：在某些实施例中，至少一个X是季铵阳离子或季鏻阳离子，其任选被至少一个R取代。所述R可以选自由氢、烷基或芳香族有机衍生物组成的组。在其它实施例中，电荷单元是选自由以下组成的组的化学部分：肉碱、咪唑鎓、吡啶鎓、四乙胺、苯甲烃铵胺、烷基苯乙铵胺、三苯基鏻阳离子以及三烷基(2,3-二羟基丙基)。质量标记单元可包括化学部分的排列，其在电离时产生一个或多个碎片。在这些实施例中，一个或多个碎片中的至少一个在质谱中具有预定义的质荷比值。在某些实施例中，质量标记或质量标记的一个或多个碎片的质谱中的预定义质荷比值不同于质谱中的背景质荷比值。本专利技术的其它方面包括用于检测样品中的靶标分析物的方法。这些方法可以包括将带电质量标记组合物引入包含靶标分析物的样品，其中带电质量标记组合物包含亲和试剂；和与亲和试剂结合的质量标记前体，其中质量标记前体包含标记结合单元和质量标记，标记结合单元将质量标记可逆地结合到亲和试剂，并且其中质量标记包含电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。所述方法然后包括培育样品和带电质量标记组合物，使得带电质量标记组合物通过带电质量标记组合物的亲和试剂和靶标分析物之间的相互作用结合靶标分析物。然后通过破坏标记结合单元的一个或多个键从亲和试剂释放质量标记。质量标记被电离并且在质谱仪中检测电离的质量标记和/或其碎片，从而检测样品中的靶标分析物。本专利技术的方法还可包括定量电离的质量标记和/或其碎片，从而定量样品中的靶标分析物。本专利技术的方法可以与各种类型的样品一起使用，例如生物样品、环境样品、农业样品等。在某些实施例中，靶标分析物是靶标生物分子。通常，靶标生物分子的存在指示疾病，例如癌症。本文描述的其它实例涉及通过质谱法(MS)检测疑似含有一种或多种不同稀有分子和非稀有分子群的样品中的一种或多种不同靶标稀有分子群的方法。用亲和剂检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带电质量标记组合物，其包含：亲和试剂；和与所述亲和试剂结合的质量标记前体，其中所述质量标记前体包含标记结合单元和质量标记，所述标记结合单元将所述质量标记可逆地结合到所述亲和试剂，并且其中所述质量标记包含电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.22 US 62/286,1151.一种带电质量标记组合物，其包含：亲和试剂；和与所述亲和试剂结合的质量标记前体，其中所述质量标记前体包含标记结合单元和质量标记，所述标记结合单元将所述质量标记可逆地结合到所述亲和试剂，并且其中所述质量标记包含电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。2.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述亲和试剂包含特异性结合对的至少一个成员。3.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述电荷单元包含一个或多个化学部分，其被布置成在电离时具有电荷。4.根据权利要求3所述的带电质量标记组合物，其中所述电荷单元包含一个或多个选自由式I-VII组成的组的化学部分：其中至少一个X是季铵阳离子或季鏻阳离子，其任选被至少一个选自由氢、烷基或芳香族有机衍生物组成的组的R取代。5.根据权利要求3所述的带电质量标记组合物，其中所述电荷单元是选自由以下组成的组的化学部分：肉碱、咪唑鎓、吡啶鎓、四乙胺、苯甲烃铵胺、烷基苯乙铵胺、三苯基鏻阳离子以及三烷基(2,3-二羟基丙基)。6.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记单元包含在电离时产生一个或多个碎片的化学部分的排列，其中所述一个或多个碎片中的至少一个在质谱中具有预定义的质荷比值。7.根据权利要求6所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记或所述质量标记的一个或多个碎片的质谱中的预定义质荷比值不同于所述质谱中的背景质荷比值。8.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记单元和所述电荷单元通过一个或多个抗电离时断裂的键彼此结合。9.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述标记结合单元包含可逆键。10.根据权利要求9所述的带电质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·格雷厄姆·库克斯，Z·贝尔德，M·普吉亚，A·霍勒巴赫，S·艾尔顿，
申请(专利权)人：普度研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US