一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法技术

本发明专利技术提供了一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,包括如下步骤：(1)所述海洋细菌为海洋不动杆菌，首先取得海洋不动杆菌菌种；(2)将海洋不动杆菌菌种进行发酵得生物表面活性剂发酵液；(3)将无柄小叶榕种植于污染土壤中，再将生物表面活性剂发酵液添加至污染土壤中，与无柄小叶榕联合修复污染土壤。本发明专利技术植物修复、海洋微生物产的生物表面活性剂强化修复均绿色、环保、无二次污染，将二者有效结合，避免了化学强化剂易残留、难降解、生物毒性等弊端，利用生物表面活性剂增溶、增流效果，提高土壤中有效态重金属含量，利于植物吸收，对植物进行重金属污染场地的修复有强化效果，有利于海洋资源开发，应用前景广阔。

A method of marine bacteria combined with phytoremediation for heavy metal contaminated saline soil

The invention provides a method for remediation of saline-alkali soil polluted by heavy metals by marine bacteria combined with phytoremediation, which comprises the following steps: (1) the marine bacteria are Acinetobacter marinus, and the Acinetobacter marinus strains are obtained first; (2) the Acinetobacter marinus strains are fermented to produce the fermentation broth of biosurfactant; (3) the sessile fig species are fermented. Planted in contaminated soil, the fermentation broth of biosurfactant was added to the contaminated soil to remediate the contaminated soil with Ficus sessile. The phytoremediation and enhanced remediation of biosurfactants produced by marine microorganisms are green, environmentally friendly and non-secondary pollution. The combination of the two effectively avoids the disadvantages of chemical intensifiers such as easy residue, difficult degradation and biological toxicity. The solubilization and flow enhancement effects of biosurfactants are utilized to improve the available heavy metals in soil. Content is conducive to plant absorption, and the remediation of heavy metal contaminated sites has enhanced effect. It is conducive to the development of marine resources and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法
本专利技术涉及一种重污染土壤修复
，尤其涉及一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法。
技术介绍
在人为和自然作用的影响下，土壤中重金属高于原生含量、并造成生态环境质量恶化的现象越发普遍。由于重金属在土壤中一般只能发生形态的转变和迁移，难以降解，同时在不同形态下引起的毒性不同，因而极易长期潜伏，产生生物放大作用，对植物和人类造成不可忽视的危害。因此，利用生物表面活性剂的阴离子(带负电荷)性对土壤中重金属的修复作用，它能够吸附到土壤上与重金属离子结合，使其从土壤颗粒上分离出来进入土壤溶液中，结合到表面活性剂胶束中，促进土壤颗粒上重金属离子的去除，是修复重金属污染土壤的重要途径。生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的次级代谢产物，它本身具有分散、增溶、润湿、渗透等特性，能够降低界面张力和表面张力。与合成表面活性剂相类似，生物表面活性剂的分子结构主要由两部分组成：一部分是疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、磷酸基等；另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。疏水基一般为脂肪酰基链,极性亲水基则有多种形式,如中性脂的酯或醇官能团。利用其两亲的特殊性质，通过胶束的分配作用和改变界面张力显著增加疏水性有机物在水中的溶解度，对污染土壤进行清洗处理，成为一种典型的修复技术。在土壤修复中，添加生物表面活性剂或者生物表面活性剂产生菌克服了物理和化学修复方法的众多缺点，特别是能够大幅缩短修复时间、提高修复效率，并且能够保持良好的环境友好性。但是现有的生物表面活性剂刚刚起步，品种较少，修复效果也欠佳，使用方法也比较单一。如何开发出新品种的生物表面活性剂及使用方法是目前急需解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用海洋细菌再生产得到生物表面活性剂，然后联合植物修复重金属污染土壤的方法。植物修复、海洋微生物产的生物表面活性剂强化修复均绿色、环保、无二次污染，将二者有效结合，避免了化学强化剂易残留、难降解、生物毒性等弊端，利用生物表面活性剂增溶、增流效果，提高土壤中有效态重金属含量，利于植物吸收，对植物进行重金属污染场地的修复有强化效果，有利于海洋资源开发，应用前景广阔。本专利技术的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,包括如下步骤：(1)所述海洋细菌为海洋不动杆菌，首先取得海洋不动杆菌菌种；(2)将海洋不动杆菌菌种进行发酵得生物表面活性剂发酵液；(3)将无柄小叶榕种植于污染土壤中，再将生物表面活性剂发酵液添加至污染土壤中，与无柄小叶榕联合修复污染土壤。优选所述步骤(2)的发酵温度为28℃，摇床培养条件为150rpm·min-1、72小时后得生物表面活性剂发酵液。优选所述步骤(3)为首先将生物表面活性剂定量：将步骤(2)中的发酵液依次经过酸沉淀法粗提、减压蒸馏纯提取、最后经真空冷冻干燥提取得纯的生物表面活性剂粉末，将粉末称量计算生物表面活性剂的产率；以干土质量计，生物表面活性剂纯品在土壤中的添加浓度10mg·kg-1—1000mg·kg-1，优选100mg·kg-1—300mg·kg-1；通过生物表面活性剂的产率计算生物表面活性剂发酵液在土壤中的添加量进行添加。发酵液添加方式为一次性添加或者分多次添加。比如要求添加量为200mg·kg-1，可分两次添加，每次倒入的发酵液中含纯表面活性剂的重量为100mg·kg-1。本专利技术在步骤(3)中还添加有化学螯合剂柠檬酸或者乙二胺四乙酸，两者在土壤中的添加量均为0.1mmol·kg-1-10mmol·kg-1，优选添加量均为1mmol·kg-1。本专利技术所述步骤(1)具体包括如下步骤：(a)将采集的海水和底泥浓缩液进行富集培养并进行筛选；(b)通过生理生化以及分子生物学方法对筛选得到的菌株进行鉴定得海洋不动杆菌。优选所述步骤(1)的详细步骤如下：(a)菌种分离、筛选：将采来的海水样品和经无菌水处理的底泥浓缩液在灭菌的人工海水培养基中，28℃，200r/min条件下进行富集培养；微生物可通过下述方法进行筛选：①柴油降解率测定，②液滴坍塌实验，③免疫溶血实验，④排油圈大小的测定，⑤表面张力测定；(b)菌种鉴定：对筛选得到的制造生物表面活性剂的菌株进行分子生物学鉴定，16SrRNA序列分析；菌株经MA(DifcoTMMatineAgra2216)28℃，24h纯化培养，利用Axygen基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测细菌DNA质量，在TEBuffer管中将DNA稀释至70ng/μL用作PCR扩增模板，细菌利用正向反应物为(5'-3'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，(5'-3'GGTTACCTTGTTACGACTT)进行16S序列扩增，扩增体系：模板DNA0.5μL，10×Buffer5μL，25mMMgCl24μL，dNTP1μL，正向及反向引物(10μM)1μL，TaqDNA聚合酶0.25μL；利用细菌模式网站http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/和NCBI对比，找出与目的基因同源性最高的已知菌种，从GenBank数据库中找出近源菌株的16SrRNA序列，与测定序列共同进行ClustalX程序校准多序列比较。进一步地，通过革兰氏染色、甲基红实验、乙酰甲基醇实验、糖发酵实验、柠檬酸实验、明胶液化实验、吲哚试验、硫化氢实验等生理生化鉴定。本专利技术所述步骤(2)包括如下步骤：发酵培养基具体成分为硫酸铵10.0g·L-1，氯化钾1.1g·L-1,氯化钠1.1g·L-1,磷酸二氢钾3.4g·L-1,酵母膏0.5g·L-1,三水合磷酸氢二钾2.46g·L-1,微量元素5mL·L-1,正十六烷20mL·L-1,余量为超纯水；初始pH7.4，超净工作台内接菌，28℃、150rpm·min-1摇床培养，发酵72小时，灭菌条件：121℃、20min；微量元素溶液为七水合硫酸锌29g·L-1，氯化钙24g·L-1，无水硫酸铜25g·L-1，一水合硫酸锰17g·L-1，七水合硫酸镁10g·100mL-1，0.056g·L-1七水合硫酸亚铁，用0.22μm的滤膜过滤除菌；发酵液pH调至8，12000rpm·min-1离心30min去除菌体。本专利技术所述的生物表面活性剂是脂肽类生物表面活性剂。有益效果无柄小叶榕为温州乡土树种，为盐碱地适生树种,在pH8.01，含盐量3.7‰的重度盐碱条件下，无柄小叶榕成活率100％,利用无柄小叶榕进行重金属污染盐碱地的修复，植物成活得到保障，且不仅绿化环境，还易于管理、无二次污染。其对重金属污染土壤的修复可归为植物提取，即通过植物的吸收作用将土壤环境中的重金属迁移至地上部分；植物固定，重金属不被植物利用，有毒有害的重金属污染物仅被植物根系固定在其周围，降低重金属的活动性，进一步阻止其向更深层土壤或地下水迁移。另外根际流出物与生物表面活性剂的复配提高了重金属可用性和植物富集力，重金属不断向植物地上部分转移，成年后无柄小叶榕生物量大，地上部分积累大量重金属，可通过收获地上部分，去除土壤中重金属。本专利技术的海洋不动杆菌能高产脂肽类生物表面活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,其特征在于包括如下步骤：(1)所述海洋细菌为海洋不动杆菌，首先取得海洋不动杆菌菌种；(2)将海洋不动杆菌菌种进行发酵得生物表面活性剂发酵液；(3)将无柄小叶榕种植于污染土壤中，再将生物表面活性剂发酵液添加至污染土壤中，与无柄小叶榕联合修复污染土壤。

【技术特征摘要】
1.一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,其特征在于包括如下步骤：(1)所述海洋细菌为海洋不动杆菌，首先取得海洋不动杆菌菌种；(2)将海洋不动杆菌菌种进行发酵得生物表面活性剂发酵液；(3)将无柄小叶榕种植于污染土壤中，再将生物表面活性剂发酵液添加至污染土壤中，与无柄小叶榕联合修复污染土壤。2.如权利要求1所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,其特征是步骤(2)的发酵温度为28℃，摇床培养条件为150rpm·min-1、72小时后得生物表面活性剂发酵液。3.如权利要求1所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,其特征是步骤(3)为首先将生物表面活性剂定量：将步骤(2)中的发酵液依次经过酸沉淀法粗提、减压蒸馏纯提取、最后经真空冷冻干燥提取得纯的生物表面活性剂粉末，将粉末称量计算生物表面活性剂的产率；以干土质量计，生物表面活性剂纯品在土壤中的添加浓度10mg·kg-1—1000mg·kg-1，通过生物表面活性剂的产率计算生物表面活性剂发酵液在土壤中的添加量进行添加，发酵液添加方式为一次性添加或者分多次添加。4.如权利要求3所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是生物表面活性剂在土壤中的添加浓度为100mg·kg-1—300mg·kg-1。5.如权利要求1所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是在步骤(3)中还添加有化学螯合剂柠檬酸或者乙二胺四乙酸，两者在土壤中的添加量均为0.1mmol·kg-1-10mmol·kg-1。6.如权利要求5所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是柠檬酸和乙二胺四乙酸在土壤中的添加量均为1mmol·kg-1。7.如权利要求1所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是所述步骤(1)包括如下步骤：(a)将采集的海水和底泥浓缩液进行富集培养并进行筛选；(b)通过生理生化以及分子生物学方法对筛选得到的菌株进行鉴定得海洋不动杆菌。8.如权利要求7所述的一种海洋细菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是所述步骤(1)的详细步骤如下：(a)菌种分离、筛选：将采来的海水样品和经无菌水处理的底泥浓缩液在灭菌的人工海水培养基中，28℃，200r/min条件下进行富集培养；菌株可通过下述方法中的一种或多种进行筛选：①柴油...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛利云，邓欢欢，李少君，马斌斌，周筝，鲍根莲，彭路菊，马恒轶，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33