一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种丝胶蛋白微球及其制备方法与应用，包括：（1）高温碱提法提取蚕茧中的丝胶蛋白，配置成纯丝胶蛋白溶液；（2）将丝胶蛋白溶液加入玉米油中，搅拌分散，滴加交联剂，得到丝胶蛋白微球；（3）将丙酮加入混合乳液中，固化丝胶蛋白微球；（4）洗涤，干燥，得到丝胶蛋白微球固体；（5）将丝胶蛋白微球与药物共孵育，得到载药丝胶蛋白微球；（6）在中性或弱碱性条件下加入酚类物质和金属离子，得到金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶蛋白微球。本发明专利技术制备的丝胶蛋白微球结构稳定、粒径均一、在水中分散良好，保留了丝胶蛋白本身的荧光特性。由金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶蛋白微球兼具载药率高、pH敏感等特点。

Natural silk sericin microsphere encapsulated by metal organic coordination polymer and preparation method and application thereof

The invention relates to a sericin protein microsphere and its preparation method and application, including: (1) extracting sericin from silkworm cocoon by high temperature alkaline extraction and preparing pure sericin solution; (2) adding sericin solution into corn oil, stirring and dispersing, dropping and adding cross-linking agent to obtain sericin protein microsphere; (3) adding acetone to silkworm cocoon; In the mixed emulsion, sericin microspheres were solidified. (4) washing and drying were used to obtain sericin microspheres solid; (5) sericin microspheres were incubated with drugs to obtain drug loaded sericin microspheres; (6) inclusion of phenols and metal ions under neutral or weak alkaline conditions to obtain metal organic coordination polymers. Drug loaded sericin microspheres. The sericin microspheres prepared by the invention have stable structure, uniform particle size, good dispersion in water, and retain the fluorescence characteristics of sericin itself. Drug-loaded sericin microspheres encapsulated by metal-organic coordination polymers have the characteristics of high drug-loading rate and pH sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医用复合材料领域，具体指一种天然丝胶蛋白微球及由金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶蛋白微球及其制备方法和应用。
技术介绍
丝胶蛋白（SilkSericin）是蚕茧中包裹在丝素蛋白表面的一种天然高分子黏性蛋白，约占整个蚕茧含量的20-30%，主要由分子量为24-400kDa的多肽组成，包括丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸等18种氨基酸。长期以来由于人们对丝胶蛋白认识的不足导致它在丝织行业中被当成废弃物处理，浪费了大量宝贵的资源，并造成环境污染。近年来人们发现丝胶蛋白在保湿、抗菌、抗氧化、抗凝血及促细胞增殖和黏附等方面均有着突出表现，同时其良好的亲水性、生物可降解性和生物相容性使它在生物医用材料领域得到了广泛的关注。目前已有研究者将丝胶蛋白与其他高分子材料掺杂制备成复合水凝胶支架或复合膜，应用于组织工程修复及药物递送系统。此外，研究者使用溴化锂提取方法获得未降解的丝胶蛋白，利用简单的化学交联制备了多种可注射的丝胶水凝胶，这些水凝胶具有良好的生物相容性和降解性，能够支持细胞粘附和增殖，并且作为组织工程支架材料可以促进多种软组织损伤修复。丝胶蛋白作为一种可持续、易获取的天然高分子材料，具有良好的凝胶性、生物相容性、生物可降解性和天然细胞粘附性能，在组织工程修复和药物载体的研究中备受关注，具有很大的发展前景。微球（microsphere）是利用天然或合成高分子材料制备的粒径在1-100μm之间的球形颗粒。由于很多药物无法直接使用，或直接使用的效果不理想，人们利用高分子材料包埋药物制得载药微球，从而达到控制给药的效果。高分子微球不仅具有固相化载体特有的易于分离及提取等优点，还具有价格低廉、比表面积大、分散性良好、易于功能化、以及生物相容性可调等优势。随着人们对丝胶蛋白认识的加深，研究者们对丝胶微球的关注与探索也愈来愈多。目前制备丝胶微球的方法主要包括凝固沉淀法、喷雾干燥法以及喷雾冷冻干燥交联法，然而这些方法存在以下不足：1）制备过程复杂、不易实施，如喷雾冷冻干燥法需将丝胶混合溶液喷雾入-80℃空间进行凝结并收集，经冻干后才可获得丝胶微球；2）制得的微球粒径大小难以精确控制，如采用凝固沉淀法制备的丝胶微球，其形貌与大小难以控制；3）搭载药物的释放速率不易控制，如采用凝固沉淀法或喷雾冷冻干燥法制备的载药丝胶微球药物释放速度过快。基于以上，我们首次采用油包水乳化法结合化学交联法成功制备出了形貌规整、粒径均一、分散性良好的丝胶蛋白微球。该方法简单易行、产率高、无毒副产物、制备过程无毒无害；获得的丝胶微球表面光滑、尺寸可控制（5-100μm）、兼具荧光特性；该微球基于丝胶蛋白本身良好的生物相容性和细胞粘附性，可有效进行药物及细胞的搭载。进一步，利用层层自组装的方法在该载药微球表面包裹上多层金属有机配位聚合物，能够通过改变包裹在微球表面的聚合物的层数控制药物的释放速度，并且能够根据环境的pH值进行响应性智能释放药物。乳化法制备的天然丝胶蛋白微球及金属有机配位聚合物包裹的丝胶微球在药物载体、细胞载体、肿瘤诊疗、荧光示踪及组织工程等研究领域具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服以往微球制备方法的不足，提供一种工艺简单、产率高、生物相容性良好的丝胶蛋白微球和金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶蛋白微球的制备方法和用途。为达到上述目的，本专利技术提供的丝胶蛋白微球、金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶蛋白微球及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)称取一定量蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，经离心、透析、冻干即可得到天然丝胶蛋白固体；(2)将步骤(1)中所得丝胶蛋白固体溶于水配制成10wt%浓度的丝胶蛋白溶液；(3)将步骤(2)中所得丝胶蛋白溶液逐滴加入玉米油中(含一定量乳化剂吐温-20)，搅拌使其充分乳化；(4)向步骤(3)中所得乳液中滴加交联剂，搅拌使其充分交联；(5)向步骤(4)中所得乳液中滴加丙酮，搅拌使其充分固化；(6)将步骤(5)所得混合液离心得固化的丝胶蛋白微球，丙酮洗涤三遍，真空抽干可得纯天然丝胶蛋白微球固体。(7)将步骤(6)所得天然丝胶蛋白微球与药物混合反应，得到负载药物的丝胶蛋白微球。(8)将步骤(7)所得载药丝胶微球在缓冲液中与酚类物质如单宁酸和金属离子如铁离子溶液中反应，得到由金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶微球；或使用步骤(6)所得天然丝胶蛋白微球缓冲液中与酚类物质如单宁酸和金属离子如铁离子溶液中反应，得到由金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶微球。进一步地，所述步骤(1)中选用的蚕茧为正常家蚕蚕茧品种（白玉，皓月等），家蚕丝素缺失型突变品种（185Nd-s，140Nd-s等）购于中国农业科学院蚕业研究所。进一步地，提取丝胶蛋白的具体过程包括以下步骤：1)称取一定量蚕茧，将其剪碎，用水清洗，挤压去除水分；2)将步骤1)所得蚕茧碎片浸泡于浓度为0.01-0.20mol/L的Na2CO3水溶液中，80-100℃,600rpm加热搅拌反应0.5-1小时，其中每克蚕茧加入20-30mLNa2CO3水溶液；3)将步骤2)中溶液以3500rpm离心5-10min，去除不溶性沉淀，得到澄清溶液；4)将步骤3)中所得溶液以MW:3500Da的透析袋在去离子水中透析2-3天，每隔6小时换水一次；5)将步骤4)中所得溶液以8000rpm离心10-15min，去除不溶性沉淀，得到澄清溶液；6)将步骤5)中所得溶液于液氮中速冻，置于真空冷冻干燥机中2-3天直至完全冻干，得到纯净的丝胶蛋白固体，置于-20℃冰箱密封保存。进一步地，所述步骤(3)中丝胶蛋白溶液与玉米油的用量为1:5-20，即1mL:5-20mL；玉米油中乳化剂吐温-20用量为1-10%，即10mL玉米油中含有吐温-20100-1000μL，搅拌速度为800rpm，乳化时间为10-30min。进一步地，所述步骤(4)中交联剂戊二醛浓度为25%，加入量为反应体系的5-20%，即10mL反应体系中加入25%戊二醛0.5-2.0mL；搅拌速度为800rpm，交联时间为1-4小时。进一步地，所述步骤(5)中加入丙酮的量为反应体系的5-10倍，即10mL反应体系中加入丙酮50-100mL；搅拌速度为800rpm，固化时间为20-60分钟。进一步地，所述步骤(7)中药物为抗肿瘤药物、激素或抗生素。进一步地，所述步骤(8)中pH7.0-9.0的Tris缓冲液浓度为10-20mM,加入的单宁酸溶液和六水合氯化铁溶液浓度分别为20-40mg/mL和10-20mg/mL，加入量均为0.5-1.0%，即1mL体系中加入单宁酸和六水合氯化铁溶液各5-10μL。进一步地，所述步骤(8)中采用的单宁酸可以替换为如花青素、儿茶素、没食子酸、熊果苷等其他常见天然多酚类物质以及邻苯二酚修饰的聚合物。进一步地，所述步骤(8)中采用的铁离子溶液可以替换为铝离子、铜离子、镁离子等其他金属离子溶液。本专利技术提供了一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球载体的制备方法。本专利技术可以通过调节丝胶蛋白浓度、乳化剂浓度及水油比等来控制微球的大小及形态，同时可以通过改变表面包裹的金属有机配位聚合物的层数来控制药物的释放速度，可用于不同的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.天然丝胶蛋白微球的制备方法，所述天然丝胶蛋白微球为天然丝胶蛋白制成的多孔微球，其制备方法包括以下步骤：(1)称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，经离心、透析、冻干即可得到纯天然丝胶蛋白固体；(2)将步骤(1)中所得丝胶蛋白固体溶于水配制成10 wt%浓度的丝胶蛋白溶液；(3)将步骤(2)中所得丝胶蛋白溶液逐滴加入含乳化剂吐温‑20的玉米油中，搅拌使其充分乳化得乳液；(4)向步骤(3)所得乳液中滴加化学交联剂，搅拌使其充分交联得交联乳液；(5)向步骤(4)所得交联乳液中滴加丙酮，搅拌使其充分固化；(6)将步骤(5)所得混合液离心得固化的丝胶蛋白微球，丙酮洗涤三遍，经真空抽干可得纯天然丝胶蛋白微球。

【技术特征摘要】
1.天然丝胶蛋白微球的制备方法，所述天然丝胶蛋白微球为天然丝胶蛋白制成的多孔微球，其制备方法包括以下步骤：(1)称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，经离心、透析、冻干即可得到纯天然丝胶蛋白固体；(2)将步骤(1)中所得丝胶蛋白固体溶于水配制成10wt%浓度的丝胶蛋白溶液；(3)将步骤(2)中所得丝胶蛋白溶液逐滴加入含乳化剂吐温-20的玉米油中，搅拌使其充分乳化得乳液；(4)向步骤(3)所得乳液中滴加化学交联剂，搅拌使其充分交联得交联乳液；(5)向步骤(4)所得交联乳液中滴加丙酮，搅拌使其充分固化；(6)将步骤(5)所得混合液离心得固化的丝胶蛋白微球，丙酮洗涤三遍，经真空抽干可得纯天然丝胶蛋白微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中丝胶蛋白固体的提取方法，包括以下步骤：1)称取普通家蚕蚕茧或丝素缺失型突变蚕茧，将其剪碎，用去离子水清洗，挤压去除多余水分得蚕茧碎片；2)将步骤1)所得蚕茧碎片浸泡于浓度为0.01-0.2mol/L的Na2CO3溶液中，在80-100℃、600rpm条件下加热搅拌反应0.5-1小时，其中每克蚕茧分散于10-50mLNa2CO3溶液；3)将步骤2)中得到的溶液以3500rpm离心5min，去除不溶性沉淀，得到澄清溶液Ⅰ；4)将步骤3)中所得澄清溶液Ⅰ在去离子水中透析2-3天，每隔6小时换水一次；得到透析溶液；5)将步骤4)中所得透析溶液以8000rpm离心10min，去除不溶性沉淀，得到澄清溶液Ⅱ；6)将步骤5)中所得澄清溶液Ⅱ于液氮中速冻，置于真空冷冻干燥机中2-3天直至完全冻干，得到纯净的丝胶蛋白固体，置于-20℃冰箱密封保存。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，王征，刘佳，邓炎，李琪琳，万超，付达安，袁野，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42