本发明专利技术提供一种六价铬还原酶及其在治理水体铬污染中的应用。本发明专利技术以Pannonibacter phragmitetus BB中的铬还原酶NirK‑Cr作为还原Cr(VI)的酶制剂有效成分，该酶制剂对Cr(VI)具有较强的还原作用，能快速去除废水中的Cr(VI)，在含Cr(VI)废水处理中具有重要的应用价值。
Six valent chromium reductase and its application in the treatment of chromium pollution in water
The invention provides a six valent chromium reductase and its application in the treatment of chromium pollution in water bodies. The chromium reductase NirK_Cr in Pannonibacter phragmitetus BB is used as an effective component of an enzyme preparation for reducing Cr (VI). The enzyme preparation has a strong reducing effect on Cr (VI), can quickly remove Cr (VI) from wastewater, and has an important application value in the treatment of wastewater containing Cr (VI).
【技术实现步骤摘要】
六价铬还原酶及其在治理水体铬污染中的应用
本专利技术涉及重金属防治领域，具体地说，涉及一种六价铬还原酶及其在治理水体铬污染中的应用。
技术介绍
土壤和地下水中的铬(Cr)污染是国际上最关注的环境问题之一，其主要来源于铬盐生产、电镀、鞣革、颜料生产、采矿和冶金等行业。铬在环境中存在两种稳定的铬氧化态：与Cr(VI)相比，Cr(III)溶解性低、迁移能力弱和生物毒性低。因此，水中铬污染治理的有效策略之一就是将Cr(VI)还原成Cr(III)。其中微生物还原Cr(VI)被看作是一种具有很大应用潜力的方法，如王洋洋等人1利用PannonibacterphragmitetusBB处理Cr(VI)污染水体，但微生物修复过程仍存在周期较长的缺点，且利用微生物进行原位修复时受环境因子影响大，与土著微生物存在相互竞争，造成修复效果不稳定。目前有大量的研究报道利用酶制剂修复土壤和治理污染地下水，如利用漆酶修复DDT污染的土壤2、土壤酶修复铅污染土壤3、固定化酶修复被农药污染的土壤4、硝化细菌产生的酶对对地下水进行脱氮处理等。对于Cr(VI)污染，有大量研究报道了Cr(VI)还原酶，如Escherichiacoli中的NfsA和YieF，其最大还原速率分别为0.25和5.0μmol/min/mg5；PseudomonasputidaKT2400中的ChrR其最大还原速率为8.8μmol/min/mg6。这些蛋白酶均能在一定条件下实现Cr(VI)的有效还原，但是离大规模工业应用尚有较大差距。P.phragmitetusBB的Cr(VI)还原能力远高于经典Cr(VI)还原菌P.putidaKT2440(19.23mM>>400μM)等其他细菌6，且全基因组及功能分析显示其胞内存在Cr(VI)高效还原酶。因此，利用这类酶中的一种或多种制成酶制剂处理含Cr(VI)废水具有工业化应用潜能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种来自于PannonibacterphragmitetusBB菌的六价铬还原酶。本专利技术的另一目的是提供所述六价铬还原酶在治理水体铬污染中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的六价铬还原酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或该序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。其在GenBank中注释结果为含铜的亚硝酸盐还原酶，本专利技术的六价铬还原酶可按如下方法制备：对六价铬还原酶编码基因进行密码子优化后在大肠杆菌(如E.coliBL21)中表达获得，密码子优化前后的核苷酸序列分别如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供一种六价铬还原剂，其活性成分为所述六价铬还原酶。本专利技术还提供所述六价铬还原酶或所述六价铬还原剂在治理水体铬污染中的应用。前述的应用，向六价铬污染水体中投放所述六价铬还原酶和/或六价铬还原剂，将高水溶性的六价铬还原成低水溶性的三价铬。通过降低其迁移性达到治理目的。优选地，当污染水体中铬浓度≤100mg/L时，六价铬还原酶的投放量为0.03-0.1U/mgCr(Ⅵ)。根据动力学最大速度Vmax＝34.46μmolCr(Ⅵ)/min/mg酶蛋白折算。优选地，还原反应在pH6-8的条件下进行。酶的最适作用pH值为7。优选地，还原反应在25-45℃的温度下进行。酶的最适作用温度为35℃。本专利技术还提供一种能快速去除废水中Cr(VI)的酶制剂的制备方法，将PannonibacterphragmitetusBB菌株CGMCCNo.3052的铬还原酶基因nirK-Cr构建到表达载体上，并利用原核表达系统制备高活性的铬还原酶NirK-Cr。具体地，以PannonibacterphragmitetusBB菌株CGMCCNo.3052基因组为模板，设计如下引物，通过PCR扩增获得铬还原酶基因nirK-Cr的核酸序列(SEQIDNO:2)，将核酸序列构建到pET-22b(+)载体上，并转化BL21大肠杆感受态细胞，所得重组菌经诱导表达，分离纯化得到目的蛋白。为了进一步提高酶表达量，根据表达菌BL21对密码子的偏好性，对铬还原酶基因nirK-Cr进行密码子的优化，密码子优化后铬还原酶基因nirK-Cr的核酸序列见SEQIDNO:3。用于扩增上述铬还原酶基因nirK-Cr的引物对为(SEQIDNO:4-5)：F：5′-ATTGAATTCTATGACCCGCCGTGAAG-3′R：5′-AATCTCGAGACAGTTGCTGGGGATC-3′借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术以PannonibacterphragmitetusBB中的铬还原酶NirK-Cr作为还原Cr(VI)的酶制剂有效成分，该酶制剂对Cr(VI)具有较强的还原作用，能快速去除废水中的Cr(VI)，在含Cr(VI)废水处理中具有重要的应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例1中Cr(VI)还原基因nirK-Cr的PCR扩增结果电泳图谱。图2为本专利技术实施例1中目的基因nirK-Cr和表达载体pET-22b(+)双酶切结果电泳图。图3为本专利技术实施例2中目的基因nirK-Cr密码子优化前后胞外表达铬还原酶NirK-Cr的SDS-PAGE图。图4为本专利技术实施例3中诱导温度对胞外表达铬还原酶NirK-Cr影响的SDS-PAGE图。其中，泳道从左至右分别对应于37℃、30℃、25℃及DNAMarker。图5为本专利技术实施例3中诱导剂IPTG浓度对胞外表达铬还原酶NirK-Cr影响的SDS-PAGE图。其中，泳道从左至右分别对应于0、0.5mM、1mM、2mM及蛋白Marker。图6为本专利技术实施例3中铬还原酶NirK-Cr纯化后的SDS-PAGE图。图7为本专利技术实施例4中温度和pH值对酶制剂活性的影响。图8为本专利技术实施例4中酶制剂对温度的耐受性。图9为本专利技术实施例5中酶制剂对含Cr(VI)废水的还原情况。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1构建Cr(VI)还原酶基因nirK-Cr的表达质粒1、引物设计与合成用primerpremier5按照基因nirK-Cr的DNA序列(NZ_KZ269956.1P874_RS13880)设计相应的引物，并加入了相应的酶切位点EcoRI和XhoI，将所设计的基因PCR引物序列(表1)在上海生工生物公司技术服务合成引物，合成量为2OD。表1PCR引物2、PCR扩增基因PCR体系(25μl)：PCRmix12.5μl；PrimerR0.5μl；PrimerF0.5μl；DNA模板(细菌总DNA)1μl；ddH2O10.5μl。PCR扩增程序：95℃变性5min，然后进入循环：95℃使DNA变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后再72℃延伸7min。3、PCR产物的电泳与切胶回收将PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，并利用EB染色后观察条带大小，然后切胶，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.六价铬还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.六价铬还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或该序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.权利要求1所述六价铬还原酶的制备方法，其特征在于，对六价铬还原酶编码基因进行密码子优化后在大肠杆菌中表达获得，密码子优化前后的核苷酸序列分别如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。3.六价铬还原剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的六价铬还原酶。4.权利要求1所述六价铬还原酶或权利要求3所述六价铬还原剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖骐，丁春连，唐佳琪，杨志辉，王海鹰，杨卫春，唐崇俭，颜旭，李青竹，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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