一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：1)将生物素与大肠杆菌抗体偶联，得到生物素化的大肠杆菌抗体；2)生物素化的大肠杆菌抗体和链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合，制备磁性纳米探针；3)使用PBS缓冲液冲洗磁性纳米探针后，将磁性纳米探针加入到大肠杆菌溶液中，使大肠杆菌被磁性纳米探针捕获；4)捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，将捕获有大肠杆菌的磁性纳米探针进行富集；5)采用清洗液对富集的样品进行清洗，得到用于ATP发光的溶液，磁性纳米探针被磁性分离架富集分离；向裂解后的溶液中加入荧光素和Mg2+，通过检测溶液的荧光强度，计算得到大肠杆菌的数量。

A detection method of Escherichia coli based on immunomagnetic separation technology and bioluminescence Technology

The invention discloses a detection method for E. coli based on immunomagnetic separation technology and bioluminescence technology, including the following steps: 1) coupling biotin with E. coli antibody to obtain biotinylated E. coli antibody; 2) mixing biotinylated E. coli antibody with magnetic nanoparticles modified by streptavidin (3) After washing the magnetic nanoprobe with PBS buffer, the magnetic nanoprobe was added to the solution of E. coli, and the E. coli was captured by the magnetic nanoprobe. 4) The solution after capturing E. coli was placed in a centrifugal tube, and the magnetic nanoprobe with E. coli was enriched. The enriched samples were cleaned with cleaning solution to obtain a solution for ATP luminescence. The magnetic nanoprobe was enriched and separated by magnetic separator. Fluorescein and Mg2+ were added to the decomposed solution, and the number of E. coli was calculated by measuring the fluorescence intensity of the solution.

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法
本专利技术涉及食品安全检测领域，特别是一种基于免疫磁分离技术和ATP生物发光技术的食品中大肠杆菌数量的检测方法。
技术介绍
目前对大肠杆菌的检测方法包括平板稀释法、滤膜法、荧光淬灭法等，这些检测方法都具有较高的灵敏度，但是都存在一定的不足，如，这些传统方法经常需要1-3天并且需要严格的实验环境培养细菌，这就决定了这些方法无法满足快速检测的要求。免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法(IMS)将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集，磁分离。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在磁珠捕获效率低、需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞、微米磁珠单分散性较差，在食品基质液中容易发生自身聚集或形成沉淀、食品基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对食品样液中目的菌的特异性分离、微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损，导致分离的失败、抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降等局限。目前，对大肠杆菌的定量检测尚缺乏快速、准确的技术手段。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，这两种技术的结合不仅提高了大肠杆菌的捕获效率，还提高了大肠杆菌数量的测量精度。为了达到以上目的，本专利技术的技术方案为：一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：1)将生物素与大肠杆菌抗体偶联，得到生物素化的大肠杆菌抗体；2)生物素化的大肠杆菌抗体和链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合，制备磁性纳米探针；3)使用PBS缓冲液冲洗磁性纳米探针后，将磁性纳米探针加入到大肠杆菌溶液中，培养，使大肠杆菌被磁性纳米探针捕获；4)捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，在离心管的一侧放置磁性分离架，将捕获有大肠杆菌的磁性纳米探针进行富集；5)采用清洗液对步骤4)中富集的样品进行清洗，得到用于ATP发光的溶液，磁性纳米探针被磁性分离架富集分离；6)向步骤5)中得到的用于ATP发光的溶液中加入ATP擦除剂设定时间后，去除溶液中体细胞和游离ATP，再加入细菌裂解剂，对大肠杆菌进行裂解；7)向步骤6)中裂解后的溶液中加入荧光素和Mg2+，通过检测溶液的荧光强度，计算得到大肠杆菌的数量。优选的，步骤1)中，生物素与大肠杆菌抗体的摩尔比为1:1。优选的，步骤2)中，磁性纳米颗粒的粒径为1-100nm，优选为60-80nm。优选的，步骤3)中，培养的时间为5-15min，优选为10min。优选的，步骤5)中，所述清洗液为10mmol/L的PBS缓冲液，PBS缓冲液中的Tween-20的质量分数为0.05％。该清洗液可以有效地将大肠杆菌从磁性纳米探针上分离下来。优选的，步骤7)中，加入的荧光素和Mg2+过量。优选的，步骤4)-步骤7)在暗室中进行。优选的，步骤7)中，采用光电倍增管收集反应释放的荧光，其峰值波长范围为500-600nm。本专利技术的有益效果为：使用特殊抗体标记的纳米磁珠作为探针，通过抗原抗体间特异性结合去捕获和富集目标大肠杆菌。解决了传统方法所需时间长，无法满足快速检测的问题。保证了捕获效率，采用生物发光技术提高了大肠杆菌数量测定的精度。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。图1为磁性分离架将溶液中结合了大肠杆菌的化合物富集在一端。图2为ATP结构式。图3为荧光素和荧光素酶可以在Mg2+的催化下发生反应。图4为检测原型(主要包括光学检测单元和信号处理单元)。图5为ATP发光测试系统。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。ATP擦除剂与细菌裂解剂均购自英国Hygiena公司成品试剂。如图1所示，磁性纳米粒子与特异性抗体结合制备免疫磁性纳米探针，实现对靶大肠杆菌的捕获。所有的磁性纳米粒子在磁场作用下被富集。如图2所示，ATP(三磷酸腺苷)，广泛存在于所有生物体的细胞中。ATP由腺嘌呤分子、核糖分子和由三个相连的磷酸基团组成的核苷酸组成。如图3所示，通常每个细菌细胞含一定量的ATP，约1～2fg，并且在细胞死亡后，ATP在几分钟内迅速降解。这个发现为利用ATP浓度测量细胞数量提供了理论依据。ATP消除试剂可以消除体细胞和游离ATP的影响；细胞裂解剂可以打破细胞壁释放其中的ATP。另一方面，荧光素酶是一种可以将化学能转化为光能的活性蛋白质。荧光素和荧光素酶可以在Mg2+的催化下发生反应。这个催化反应需在有氧环境中进行，当ATP、Mg2+和O2同时存在时，荧光素被氧化到激发态，当其从激发态回归基态时会释放荧光。溶液浓度同样会影响荧光强度，所以设置合适的溶液浓度以得到一个稳定的光强也是重要的问题。值得注意的是，ATP生物发光不需要外界激发光源，也不需要细菌培养，所以检测时间低于20min。当ATP浓度低于10-7mol/ml，其他反应物过量时，发光强度与ATP浓度存在一定的线性关系，因此大肠杆菌的数量可以通过下式间接得到：如图4所示，反应容器1包括用于捕获大肠杆菌的纳米金探针传感器。通过抗原抗体间的特异性结合高精度捕获目标病原体。用150μLPBS冲洗过后，磁珠即可用来捕获细菌。将50μL免疫磁探针溶液加入到不同浓度的大肠杆菌溶液中，分别培养10min，大肠杆菌即可通过抗原抗体反应被捕获，捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，探针通过磁性分离架完全吸附在管的一侧。富集的样品用150μL清洗液(10mmol/LPBS，0.05％Tween-20)清洗得到用于ATP发光的样品。所有的磁性纳米粒子被磁性分离架富集。反应容器2是ATP发光测试系统，它由自动加样单元和光电转换单元组成，如图5所示。用到的试剂包括：ATP擦除试剂可以去除溶液中体细胞和游离ATP。为了避免ATP自身降解，细菌裂解剂中包含抑制ATP降解的成分。为了排除外界光源的影响，所有的反应均在暗室中进行，光学校准模块解决了溶液吸收荧光的问题。如图5所示，蠕动泵上所用的管均为高弹性、低粘性、低渗透性的特制软管。单片机产生蠕动泵的控制信号。自动加样单元包括蠕动泵和试剂组。另一方面，光电转换模块包含样品反应池，光电倍增管(PMT)和光学校准模块。光电倍增管易受电磁干扰，光电转换装置全由金属制成。当细菌在溶液中时，溶液吸收荧光的问题亟待解决。光学校准也本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将生物素与大肠杆菌抗体偶联，得到生物素化的大肠杆菌抗体；2)生物素化的大肠杆菌抗体和链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合，制备磁性纳米探针；3)使用PBS缓冲液冲洗磁性纳米探针后，将磁性纳米探针加入到大肠杆菌溶液中，培养，使大肠杆菌被磁性纳米探针捕获；4)捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，在离心管的一侧放置磁性分离架，将捕获有大肠杆菌的磁性纳米探针进行富集；5)采用清洗液对步骤4)中富集的样品进行清洗，得到用于ATP发光的溶液，磁性纳米探针被磁性分离架富集分离；6)向步骤5)中得到的用于ATP发光的溶液中加入ATP擦除剂设定时间后，去除溶液中体细胞和游离ATP，再加入细菌裂解剂，对大肠杆菌进行裂解；7)向步骤6)中裂解后的溶液中加入荧光素和Mg2+，通过检测溶液的荧光强度，计算得到大肠杆菌的数量。

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将生物素与大肠杆菌抗体偶联，得到生物素化的大肠杆菌抗体；2)生物素化的大肠杆菌抗体和链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合，制备磁性纳米探针；3)使用PBS缓冲液冲洗磁性纳米探针后，将磁性纳米探针加入到大肠杆菌溶液中，培养，使大肠杆菌被磁性纳米探针捕获；4)捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，在离心管的一侧放置磁性分离架，将捕获有大肠杆菌的磁性纳米探针进行富集；5)采用清洗液对步骤4)中富集的样品进行清洗，得到用于ATP发光的溶液，磁性纳米探针被磁性分离架富集分离；6)向步骤5)中得到的用于ATP发光的溶液中加入ATP擦除剂设定时间后，去除溶液中体细胞和游离ATP，再加入细菌裂解剂，对大肠杆菌进行裂解；7)向步骤6)中裂解后的溶液中加入荧光素和Mg2+，通过检测溶液的荧光强度，计算得到大肠杆菌的数量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春兴，张志杰，杨志政，韩旭，徐元达，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37