本发明专利技术涉及诊断上皮向间充质转化(EMT)(例如间皮向间充质转化(MMT))，尤其腹膜的EMT（其经常在腹膜透析时发生）的领域。本发明专利技术提供基于标记的方法和试剂盒，所述标记包括至少一种细胞外基质蛋白，例如胶原蛋白13、胶原蛋白6和/或角蛋白34；至少一种参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，例如基质金属蛋白酶1；至少一种参与细胞‑细胞和/或细胞‑基质接触的蛋白，例如钙粘着蛋白13或血小板反应蛋白1；至少一种生长因子，例如VEGF；以及任选的至少一种BMP拮抗剂，例如Gremlin 1。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(EMT)的方法和试剂盒本专利技术涉及诊断上皮向间充质转化(EMT)，尤其间皮向间充质转化(MMT)，尤其腹膜的EMT（其经常在腹膜透析时发生）的领域。本专利技术提供基于标记的方法和试剂盒，所述标记包括至少一种细胞外基质蛋白，例如胶原蛋白13、胶原蛋白6和/或角蛋白34；至少一种参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，例如基质金属蛋白酶1；至少一种参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，例如钙粘着蛋白13或血小板反应蛋白1；至少一种生长因子，例如VEGF；以及任选的至少一种BMP拮抗剂，例如Gremlin1。在终末期肾病的治疗中，腹膜透析(PD)是血液透析(HD)的有效且有成本效率的替代方案，其覆盖了大约10-15%的透析群体。在PD期间，腹膜(peritonealmembrane或peritoneum)起半透膜的作用，穿越所述半透膜发生超滤和扩散。但是，长期使用PD仍然受到限制。接近50%的患者被迫在4年或5年的PD治疗期间内换成血液透析，因为长期暴露于生物不相容的PD流体，腹膜炎和腹腔积血发作诱导腹膜组织的退行性变化，这最终导致超滤失败。腹膜的这些进行性功能和形态改变可能由PD流体中的高葡萄糖浓度、低pH和乳酸缓冲液导致，并体现为炎性反应、间皮细胞(MC)单层的逐渐剥露、间皮下纤维化(submesothelialfibrosis)和血管新生(neoangiogenesis)。在长期PD期间，MC经历上皮特征的逐渐丧失，并获得成肌纤维细胞样表型。这种上皮向间充质转化(EMT)是一个复杂且逐步的过程，其表征为顶端-基底外侧极性(apical-basolateralpolarity)的丧失、细胞间连接的破坏以及迁移和侵袭性质的获得(Selgas等人，2006,NephrolDialTransplant21[Suppl2]:ii2-ii7；Aroeira等人，2007,JAmSocNephrol18:2004-2013)。经历EMT的MC获得产生细胞外基质组分以及炎性因子、纤维发生因子和血管生成因子的能力。在腹膜的EMT过程期间，经由转化生长因子TGF-β1和血管内皮生长因子(VEGF)的上调来触发腹膜纤维化和血管生成。然而，迄今为止，PD期间的腹膜变化不可避免，但最优化的治疗，例如使用生物相容的溶液或另一种治疗方案(例如改变填充体积和/或停留时间)可至少延迟这些变化。EMT是可逆的过程，至少在早期是可逆的。此外，可基于患者腹膜的状态来最优化PD治疗的效率。EMT是生物学过程，其不仅涉及PD期间腹膜的变化，而且其在胚胎发生和伤口愈合中起作用。EMT还可引起器官纤维化并在癌症进展和转移中起作用。EMT还已显示促成各种疾病的发病机制，所述疾病例如癌症或不同的器官(包括肺)中的退行性纤维变性病症（degenerativefibroticdisorders）(WO2014/139885A2)。WO2014/139885A2教导了基质金属蛋白酶MMP10、细胞和可溶性纤连蛋白、E-钙粘着蛋白和波形蛋白是用于EMT的标记。在现有技术中，已鉴定出用于EMT或通常纤维化（其与EMT相关联）的几种其它标记。例如，WO2011/054893A2显示了TLR-9的表达水平与纤维化之间的关联。WO2012/042091教导了基于测定TAK1来测定纤维化的进展的方法。US2013/0303563A1公开了骨膜蛋白、HSPG降解、PDGF、瘦蛋白和CD68+巨噬细胞密度是用于腹膜损伤的标记。US2013/020940A1建议BMP9或BMP10的测定有用于评估发展纤维变性病症的风险。Aroeira等人，2007年教导了PD患者的腹膜中E-钙粘着蛋白、细胞角蛋白、密蛋白、闭合蛋白、桥粒斑蛋白、ZO-1、粘蛋白-1、tPA和CD34的表达降低，以及N-钙粘着蛋白、snail、波形蛋白、TGF-β、纤连蛋白、细胞外基质蛋白，尤其胶原蛋白I和III、αSMA、FGF-1和FGF-2、MMP-2和MMP-9、FSP-1、PAI-1、VEGF以及环氧合酶-2的表达增加。但是，仍需要提供用于EMT的标记，其与经历EMT的组织的功能(例如腹膜在PD中的过滤能力)紧密相关。专利技术人已解决了提供用于诊断EMT的此类标记、相应的试剂盒和方法的问题。本专利技术的主题例如由所附权利要求书来描述。本专利技术提供了用于诊断上皮向间充质转化(EMT)（尤其MMT，或最优选腹膜的EMT）的方法，其包括检测样品中的多种标记的缺乏和/或量，所述标记包括：a)细胞外基质蛋白，b)参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，c)参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，d)生长因子，以及，任选地，e)BMP拮抗剂。在本专利技术的上下文中，除非另外明确规定，否则冠词“一（种/个）”理解为表示“一（种/个）或更多（种/个）”。因此，例如，所述标记还可包括两种或三种(或更多种)细胞外标记蛋白或两种或三种参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白。本专利技术还提供了用于诊断上皮向间充质转化(EMT)的相应试剂盒，其包含用于检测样品中的标记的试剂，所述标记包括：a)细胞外基质蛋白，b)参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，c)参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，d)生长因子，以及，任选地，e)BMP拮抗剂。优选地，若标记呈蛋白形式，则用于检测样品中的标记的试剂是抗体或其片段。抗体适合用于检测呈蛋白形式的标记。抗体或其片段可为人、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、猫、禽类（例如鸡）或嵌合来源。它们可为多克隆的或单克隆的，或通过基因工程产生。抗体片段包括例如Fab片段、Fab2片段、scFv。或者，用于检测样品中的标记的试剂可以是核酸，例如RNA或DNA，其适合用于检测呈核酸形式的标记，尤其合适用于检测标记的RNA转录体或由其衍生的cDNA。核酸优选至少部分为单链的，并且能够在严格的条件下与编码所述标记的核酸杂交。优选地，用于检测样品中的标记的试剂与固相支持体(例如芯片、可能为磁性的不同尺寸的珠等等)连接。优选地，所述试剂盒包含微阵列，特别是抗体微阵列，也称为抗体芯片。可适合于本专利技术的合适的抗体芯片格式公开于例如Wingren等人，2009,MethodsMolBiol.509:57-84；Chaga等人，2008,methodsMolBiol.441:129-51中，或可由例如AbnovaCorporation、R&DSystems、FullMoonBioSystems、Raybiotech,Inc.、BioSims和其它的公司定制。专利技术人分析了健康的间皮细胞(获得自不具有肾衰竭的患者的网膜)、上皮样细胞(即，在间皮细胞的EMT/MMT的第一步中的细胞，其具有与间皮细胞类似的表型，获得自PD患者的流出液)以及EMT晚期中的细胞(即，已改变其表型的细胞，也称为非上皮样)的基因表达。鉴定出数种一旦细胞已获得非上皮样表型就显著且特异性上调的基因。验证了它们的表达，以及与功能的关联，检查了不同的体液(包括血清和流出液)中的各自的蛋白水平。专利技术人令人惊讶地发现来自数种官能团的标记在EMT中起重要作用。专利技术人进一步发现这些标记的RNA和蛋白水平均与可得自患者的临床参数相关联，并本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于诊断上皮向间充质转化(EMT)的试剂盒，其包含用于检测样品中的标记的试剂，所述标记包括：细胞外基质蛋白，参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，参与细胞‑细胞和/或细胞‑基质接触的蛋白，生长因子，和任选的BMP拮抗剂。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.09 DE 102015115158.81.用于诊断上皮向间充质转化(EMT)的试剂盒，其包含用于检测样品中的标记的试剂，所述标记包括：细胞外基质蛋白，参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，生长因子，和任选的BMP拮抗剂。2.用于诊断上皮向间充质转化(EMT)的方法，其包括检测样品中的多种标记的缺乏和/或量，所述标记包括：细胞外基质蛋白，参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，生长因子，和任选的BMP拮抗剂。3.权利要求1所述的试剂盒或权利要求2所述的方法，其中所述用于检测所述样品中的所述标记的试剂是抗体或其片段。4.权利要求1或3所述的试剂盒或权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述用于检测所述样品中的所述标记的试剂与固相支持体连接，其中所述试剂盒优选包含抗体芯片。5.权利要求1或3-4中任一项所述的试剂盒或权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白是选自角蛋白34的角蛋白、和/或选自胶原蛋白13和胶原蛋白6的胶原蛋白，其中所述标记优选包括细胞外基质蛋白角蛋白34、胶原蛋白13和胶原蛋白6。6.权利要求1或3-5中任一项所述的试剂盒或权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白是选自基质金属蛋白酶1的基质金属蛋白酶。7.权利要求1或3-6中任一项所述的试剂盒或权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述参与细胞-细胞或细胞-基质接触的蛋白是选自钙粘着蛋白13的钙粘着蛋白、和/或选自血小板反应蛋白1的血小板反应蛋白，其中所述标记优选包括钙粘着蛋白13和血小板反应蛋白1。8.权利要求1或3-7中任一项所述的试剂盒或权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述生长因子是VEGF...
【专利技术属性】
技术研发人员：J普拉斯利克德特延，J比歇尔，S施特潘，M洛佩斯卡布雷拉，A阿吉莱拉，R塞尔加斯，
申请(专利权)人：费森尤斯医疗护理德国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE
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