一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种锦鲤疱疹病毒的RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法，所述的引物组包括引物S1、S2，其中：S1:5’‑AAGGCTTAGTAGCTTACCAT‑3’,S2：5’‑CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG‑3’，S3：5’‑ATAAGGGCTGAGTCCTGAT‑3’。本发明专利技术设计特异性引物S1、S2和S3，能够对锦鲤疱疹病毒进行特异性扩增。本发明专利技术的专用试剂盒具有很强的敏感性，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达100％，能够广泛用于锦鲤疱疹病毒的鉴别诊断。

RT-PCR detection kit for Koi herpesvirus and its detection method

The invention discloses a RT_PCR detection kit for Koi herpesvirus and a detection method thereof. The primers group comprises primers S1 and S2, wherein the primers S1:5'AAGGCTTAGCTTAGCTTACCAT, S2:5'CAAGTAGCTGAGTCGACCTATG, S3:5'ATAAGGGCTGAGCTCTCTCTCTGAT 3'. The invention designs specific primers S1, S2 and S3, which can specifically amplify Koi herpes virus. The special kit of the invention has strong sensitivity, and the coincidence rate can reach 100% compared with virus isolation and IFA method, and can be widely used for the differential diagnosis of Koi herpes virus.

【技术实现步骤摘要】
一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及兽医生物病毒检测
，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus)，简称KHV。因其主要是由DNA类疱疹滤过性病毒感染所引起，又名鲤鱼肾炎及鳃坏疽病毒，亚洲地区于2004年也被报导感染锦鲤疱疹病毒。我国将其列为二类动物疫病，是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疾病。又称鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)属疱疹病毒科，病毒有囊膜，核衣壳为二十面体，直径170～230nm，病毒核酸为双链DNA。该病多发于春、秋季，潜伏期14d，发病出现症状后24～48h开始死亡，2～4d内死亡率迅速，可达到80％～100％。由于该病锦鲤和鲤的死亡率高达75％～95％，对水产养殖业危害极大，且锦鲤疱疹病毒病目前无有效的药物和商品化的疫苗用于治疗，故建立一种锦鲤疱疹病毒的反转录PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒能够快速区分锦鲤疱疹病毒。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒，所述的引物组包括引物S1、S2、S3，其中：S1：5，-AAGGCTTAGTAGCTTACCAT-3，；S2：5，-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG-3，；S3：5，-ATAAGGGCTGAGTCCTGAT-3，。一种所述的引物组在制备用于锦鲤疱疹病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。一种所述的引物组的锦鲤疱疹病毒鉴别诊断试剂盒。所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、TaqDNA聚合酶和双蒸水。所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/LdNTP8.0μL、10mmol/LS1引物1.0μL、10mmol/LS2引物1.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。本专利技术的有益效果：本专利技术通过比对锦鲤疱疹病毒的差异，设计特异性引物S1、S2、S3，能够对锦鲤疱疹病毒进行特异性扩增；在此基础上研制了专用试剂盒，先提取病毒RNA，再使用S2引物反转录合成cDNA，并采用RT-PCR方法鉴别检测锦鲤疱疹病毒。与现有技术相比，本专利技术的专用试剂盒具有很强的敏感性，能够广泛用于临床锦鲤疱疹病毒的鉴别诊断。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。实施例1、鉴别诊断方法的构建1、引物设计设计两条特异性引物，具体如下:S1：5，-AAGGCTTAGTAGCTTACCAT-3，(SEQIDNO.1)S2：5，-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG-3，(SEQIDNO.2)S3：5，-ATAAGGGCTGAGTCCTGAT-3，(SEQIDNO.3)使用S1、S2和S3进行PCR扩增，疫苗株预期扩增片段大小为836bp，现地分离株预期扩增片段大小为578bp。2、病毒RNA的提取取毒株细胞培养液，反复冻融3次后，5000g离心15min，取上清备用。(1)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12，000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上层是无色的水相，RNA存在于水相中；(2)将步骤(1)中的上层水相转移到另一只干净的EP管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12,000g，4℃离心10min；(3)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤RNA沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；(4)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无RNAse水溶解RNA，即得到总RNA。3、反转录以步骤2提取的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA，反转录反应体系为：模板RNA4.9μLS2引物(10mmol/L)0.3μLRTase酶抑制剂(40U/μL)0.3μLM-MLV反转录酶(200U/μL)0.5μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μL10×M-MLV缓冲液2.0μL反应条件为：42℃保温60min，70℃10min。4、聚合酶链式反应(PCR)4.1PCR反应体系以步骤3获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：dNTP(2.5mmol/L)8.0μL10×PCR扩增缓冲液5μLS1引物(10mmol/L)1.0μLS2引物(10mmol/L)1.0μLS3引物(10mmol/L)1.0μLcDNA3.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)1.0μLddH2O至50μL4.2PCR反应条件优化对疫苗株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃进行PCR反应扩增疫苗株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57和62℃可以扩增出836bp大小的片段，与预期大小一致。对现地分离株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃进行PCR反应扩增现地分离株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57℃出现578bp大小的片段，与预期大小一致。综合上述反应，本专利技术最终将复合PCR的退火温度设置为57℃，优化后的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物置于-20℃保存。5、电泳对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察结果。本专利技术的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。实施例2、灵敏度实验将现地分离株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为5.4×104-5.4×10-4copies/μL，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为5.4×10-3copies/μL可扩增出预期片段，本专利技术的引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锦鲤疱疹病毒的RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的引物组包括S1、S2、S3，其中：S1：5’‑AAGGCTTAGTAGCTTACCAT‑3’；S2：5’‑CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG‑3’；S3：5’‑ATAAGGGCTGAGTCCTGAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的引物组包括S1、S2、S3，其中：S1：5’-AAGGCTTAGTAGCTTACCAT-3’；S2：5’-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG-3’；S3：5’-ATAAGGGCTGAGTCCTGAT-3’。2.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于锦鲤疱疹病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。3.一种包含如权利要求1所述的引物组的锦鲤疱疹病毒鉴别诊断试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张朝明，严裕舟，张胜辉，李文得，
申请(专利权)人：张朝明，严裕舟，张胜辉，李文得，
类型：发明
国别省市：广东,44