嵌合转录后调控元件制造技术

本发明专利技术涉及嵌合转录后调控元件（PRE）和可用于在细胞内表达蛋白的载体。所述PRE含有选自不同的天然PRE序列的α、β和任选的γ子元件，并且被发现比它们的天然对应物更有效。

Chimeric post transcriptional regulatory element

The present invention relates to chimeric post transcriptional regulatory elements (PRE) and vectors that can be used to express proteins in cells. The PRE contains alpha, beta and optional gamma elements selected from different natural PRE sequences, and is found to be more effective than their natural counterparts.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合转录后调控元件相关申请的交叉引用本申请要求2015年10月27日提交的美国临时申请序列号62/246,841根据35U.S.C.§119(e)的利益，其全文以引用的方式合并入本文中。
技术介绍
基因序列的转录(即mRNA的生成)在许多不同的水平受到控制。转录起始位点或启动子具有不同的强度，并且给定基因的转录起始频率也可以通过增强子序列增加。转录过程中的暂停可以影响转录速率，从而影响在给定时间段内产生的转录物的量。前体mRNA剪接、聚腺苷酸化和切割的速率也可以影响由转录单位产生的mRNA的水平。此外，mRNA分子内的序列可以调节其从细胞核到细胞质的转运、以及其转换率(即其细胞质稳定性)。已经鉴定了调节mRNA的细胞质积累和稳定性的mRNA分子内的某些序列，并将其表示为转录后调控(post-transcriptionalregulatory，PRE)元件。已经在人类乙型肝炎病毒(HPRE)的基因组中和在土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的基因组中鉴定出PRE序列。参见例如Donelloetal.(1998)J.Virology72:5085-5092。体外的多肽(例如治疗性抗体、生长因子)的表达对于制药工业而言是重要的，并且使蛋白表达最大化的方法是有需要的。概述本专利技术提供了嵌合(chimeric)PRE序列，其可用于生成具有改善的稳定性和表达效率的表达构建体。在一个实施方式中，本专利技术提供了一种多核苷酸，其包括：(a)第一片段，其由SEQIDNO:14的核酸序列或与SEQIDNO:14具有至少95％序列同一性(sequenceidentity)的核酸序列组成，以及(b)第二片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述第一片段距离所述第二片段不超过20个核苷酸。在一些方面，所述第一片段距离所述第二片段不超过15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸进一步包括第三片段，其由转录后调控元件(PRE)的γ子元件组成。在一些方面，所述γ子元件具有SEQIDNO:7、12、16或20的核酸序列或与SEQIDNO:7、12、16或20具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述γ子元件具有SEQIDNO:7的核酸序列或与SEQIDNO:7具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述γ子元件具有SEQIDNO:16的核酸序列或与SEQIDNO:16具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述第一片段位于所述第三片段和所述第二片段之间。在一些方面，所述第三片段距离所述第一片段不超过20个核苷酸、或替代地距离所述第一片段不超过15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸依次包括SEQIDNO:7、14和3。在一些方面，所述多核苷酸包括SEQIDNO:26的核酸序列。在一些方面，所述多核苷酸包括SEQIDNO:25的核酸序列。在一个实施方式中，本专利技术还提供了一种多核苷酸，其包括：(a)第一片段，其由SEQIDNO:7的核酸序列或与SEQIDNO:7具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由转录后调控元件(PRE)的α子元件组成，以及(c)第三片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述α子元件具有SEQIDNO:2、5、9、14或18的核酸序列或与SEQIDNO:2、5、9、14或18具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述α子元件具有SEQIDNO:2的核酸序列或与SEQIDNO:2具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述第二片段位于所述第一片段和所述第三片段之间，并且每个片段都距离相邻的片段不超过20个核苷酸、或替代地距离相邻的片段不超过15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。在另一个实施方式中，本专利技术提供了一种多核苷酸，其包括：(a)第一片段，其由SEQIDNO:5、9或18的核酸序列或与SEQIDNO:5、9或18具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(b)第二片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述多核苷酸进一步包括：(c)第三片段，其由转录后调控元件(PRE)的γ子元件组成。在一个实施方式中，本专利技术还提供了一种多核苷酸构建体，其包括本专利技术的多核苷酸以及编码蛋白的序列。在一个实施方式中，本专利技术还提供了一种多核苷酸构建体，其包括：(a)第一片段，其由SEQIDNO:14的核酸序列或与SEQIDNO:14具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(c)编码蛋白的序列。在一个实施方式中，本专利技术还提供了一种多核苷酸构建体，其包括：(a)第一片段，其由SEQIDNO:7的核酸序列或与SEQIDNO:7具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由转录后调控元件(PRE)的α子元件组成，(c)第三片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(d)编码蛋白的序列。在一个实施方式中，本专利技术还提供了一种多核苷酸构建体，其包括：(a)第一片段，其由SEQIDNO:5、9或18的核酸序列或与SEQIDNO:5、9或18具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(c)编码蛋白的序列。在这些实施方式的任一个的一个方面，所述编码蛋白的序列位于所述第一片段和所述第二片段之间。在一个方面，所述构建体进一步包括3’-UTR。在一个方面，所述3’-UTR位于所述第一片段和所述第二片段之间。在一个方面，所述构建体进一步包括poly(A)序列。在一个实施方式中，本专利技术还提供了一种细胞，其包括本专利技术的多核苷酸构建体。附图说明图1示出了各种α子元件的多重对齐(multi-alignment)。图2示出了各种β子元件的多重对齐。图3示出了各种γ子元件的多重对齐。图4示出了用于测试PRE元件的质粒(pCT2.1)的示意图。不同的PRE被克隆进在编码利妥昔单抗(Rituximab)轻链的序列和BGH聚腺苷酸化信号之间的BamHI位点。图5示出了在几个PRE构建体的两个测定(第2天和第4天)中的滴度(titer)(μg/ml)。图6示出了多个PRE构建体的相对表达倍数变化(柱：测试1、测试2、平均值)。图7A和7B示出了所示的多个PRE构建体的相对表达倍数变化。图8A和8B比较了在第2天(A)和第4天(B)构建体pCT2.52相对于WPRE(pCT2.0)和对照pCT2.1的强度。图9A和9B示出了每个所示的构建体的相对瞬时表达倍数变化。详细描述I.定义所有的数字标示(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度和分子质量，都是近似值，其通过0.1的增量变化(+)或(-)。应当理解的是，尽管并非总是明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸，其包括：（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 14的核酸序列或与SEQ ID NO: 14具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及（b）第二片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.27 US 62/246,8411.一种多核苷酸，其包括：（a）第一片段，其由SEQIDNO:14的核酸序列或与SEQIDNO:14具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及（b）第二片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一片段距离所述第二片段不超过20个核苷酸。3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其进一步包括：（c）第三片段，其由转录后调控元件（PRE）的γ子元件组成。4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述γ子元件具有SEQIDNO:7、12、16或20的核酸序列或与SEQIDNO:7、12、16或20具有至少95%序列同一性的核酸序列。5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述γ子元件具有SEQIDNO:7的核酸序列或与SEQIDNO:7具有至少95%序列同一性的核酸序列。6.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述γ子元件具有SEQIDNO:16的核酸序列或与SEQIDNO:16具有至少95%序列同一性的核酸序列。7.根据权利要求3-6的任一项所述的多核苷酸，其中所述第一片段位于所述第三片段和所述第二片段之间。8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述第三片段距离所述第一片段不超过20个核苷酸。9.根据权利要求5所述的多核苷酸，其依次包括SEQIDNO:7、14和3。10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其包括SEQIDNO:26的核酸序列。11.根据权利要求6所述的多核苷酸，其包括SEQIDNO:25的核酸序列。12.一种多核苷酸，其包括：（a）第一片段，其由SEQIDNO:7的核酸序列或与SEQIDNO:7具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，（b）第二片段，其由转录后调控元件（PRE）的α子元件组成，以及（c）第三片段，其由SEQIDNO:3的核酸序列或与SEQIDNO:3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成。13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述α子元件具有SEQIDNO:2、5、9、14或18的核酸序列或与SEQIDNO:2、5、9、14或18具有至少95%序列同一性的核酸序列。14.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述α子元件具有SEQIDNO:2的核酸序列或与SEQIDNO:2具有至少95%序...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼基尔·高尔，阿米塔·高尔，
申请(专利权)人：赛尔希恩公司，
类型：发明
国别省市：美国,US