由3-羟基丙酸诱导表达的启动子系统及用其生物生产3-羟基丙酸的方法技术方案

本发明专利技术涉及由3‑羟基丙酸诱导表达的启动子系统以及使用该启动子系统生物生产3‑羟基丙酸的方法。为了在生物学上提高3‑HP生产，需要连续生产具有酶活性的新酶。从包括脱氮假单胞菌在内的几种微生物中筛选与3‑HP反应的启动子和转录调节因子的结果是，证实了这些转录调节因子和启动子由LysR蛋白和结合至该蛋白的特定基因核苷酸序列组成。因此，预期根据本发明专利技术的3‑HP诱导型系统可有效地用于调节3‑HP代谢途径。

Promoter system induced by 3- hydroxypropionic acid and method for producing 3- hydroxypropionic acid by using it

The invention relates to a promoter system induced by 3 hydroxypropionic acid and a method for producing 3 hydroxypropionic acid by using the promoter system. In order to improve the production of 3 HP in biology, it is necessary to continuously produce new enzymes with enzyme activity. The results of the screening of promoters and transcriptional regulators from several microbes, including Pseudomonas denitrification, in response to 3 HP, confirmed that these transcriptional regulators and promoters were composed of LysR proteins and specific nucleotide sequences binding to the protein. Therefore, it is expected that the 3 - HP inducible system according to the invention can be effectively used to regulate the 3 - HP metabolic pathway.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由3-羟基丙酸诱导表达的启动子系统及用其生物生产3-羟基丙酸的方法
本专利技术涉及由3-羟基丙酸(3-HP)诱导表达的启动子系统以及用于生物生产3-HP的方法。
技术介绍
3-羟基丙酸(3-HP)是用于各种化学过程中的重要合成中间体，作为原料用于生产丙烯酸、丙烯酰胺、1,3-丙二醇、丙二酸等。3-HP也被用于合成可生物降解的聚合物。通过对各种细菌中3-HP生产途径所需的关键酶进行基因工程化，成功实现了使用甘油进行的3-HP生物生产。具体而言，已经证实了在诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)等细菌中，通过基因工程(过)表达甘油脱水酶(一种辅酶B12依赖性酶)、DhaB再激活酶(DhaBreactivase)(一种甘油脱水酶的再激活酶)和乙醛脱氢酶(一种NAD+依赖性酶)等来生产3-HP。一些重组菌株(包括大肠杆菌WDUBGK)能够在48小时内生产超过40g/L3-HP，但很难在此基础上再提高3-HP生产。尤其是，观察到随着3-HP生产的发酵时间持续，发生了酶(例如甘油脱水酶和乙醛脱氢酶)变得不稳定或失去活性的问题。就此而言，甘油脱水酶活性消失的一个重要原因在于被称为自杀失活(suicidalinactivation)的机制。在这种机制下，在从甘油到3-羟基丙醛(3-HPA)的脱水反应中，辅酶B12(甘油脱水酶的辅酶)受到不可逆的损伤，并且在存在氧的情况下此类失活反应得到促进。近年来，为了减轻基于上述机制的失活，已经根据定点突变开发出了突变型甘油脱水酶。已经发现几种突变酶具有改善的酶稳定性，但是当与常规的酶相比时，仍观察到其酶活性显著降低。上述问题的另一个原因在于3-HPA(高反应性中间产物)的毒性。当甘油脱水酶或乙醛脱氢酶与3-HPA一起存在时，甘油脱水酶或乙醛脱氢酶的活性随着3-HPA的浓度而降低。已知乙醛与分别存在于赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸中的氨基酸残基(例如ε-氨基酸(NH3+)、巯基(-C-SH)和咪唑基)进行反应。已经尝试使用定点突变和随机突变来提高在乙醛存在时许多酶的稳定性，但成功的情况却很有限。解决这些酶变得不稳定的问题的一个有趣的替代方法是在整个细胞培养期间连续地合成具有活性的新酶。从理论上讲，如果能够提供与变得不稳定的酶一样多的新酶，那么细胞中酶的酶活性可以保持不变。特别地，在发酵后期由于高浓度3-HP的存在而导致细胞生长减慢并且细胞总代谢活性降低的时候，需要连续地表达酶。
技术实现思路
技术问题本专利技术提供了针对3-羟基丙酸(3-HP)或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3-HP或其衍生物具有反应性的LysR蛋白的结合位点。本专利技术还提供了对3-HP或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒，所述重组基因表达盒包含：编码LysR蛋白(对3-HP或其衍生物具有反应性)的lysR基因、含有LysR蛋白结合位点的启动子、以及编码目标表达蛋白的基因。技术方案为了解决上述技术问题，本专利技术提供了针对3-羟基丙酸(3-HP)或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3-HP或其衍生物具有反应性的LysR蛋白的结合位点。另外，本专利技术涉及包含所述针对3-HP或其衍生物的诱导型启动子的重组表达载体、经所述重组表达载体转化的重组微生物、以及生产3-HP的方法(所述方法包括对所述重组微生物进行培养)。此外，本专利技术提供了对3-HP或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒，所述重组基因表达盒包含：编码LysR蛋白(对3-HP或其衍生物具有反应性)的lysR基因、含有LysR蛋白结合位点的启动子、以及编码目标表达蛋白的基因。另外，本专利技术提供了包含所述对3-HP或其衍生物具有反应性的重组基因表达盒的重组表达载体、经所述重组表达载体转化的重组微生物、包含所述重组基因表达盒(其对3-HP或其衍生物具有反应性，被插入宿主细胞的染色体中)的重组微生物、以及生产目标表达蛋白的方法(所述方法包括对所述重组微生物进行培养)。有益效果本专利技术涉及由3-羟基丙酸(3-HP)诱导表达的启动子系统和使用该启动子系统生物生产3-HP的方法。为了以生物学方式提高3-HP生产，需要连续地合成具有酶活性的新酶。作为对来自几种微生物(包括脱氮假单胞菌)的3-HP反应性转录调节因子和3-HP反应性启动子进行筛选的结果，证实了这些转录调节因子和启动子由LysR蛋白和结合至LysR蛋白的特定基因核苷酸序列组成。因此，预期所述3-HP诱导系统将有效地用于调节3-HP代谢途径。附图说明图1示出了增殖细胞中3-羟基丙酸(3-HP)的生产(A)和3-HP的降解(B)。在补充有25±2mmol/L3-HP作为单一碳源和能量源的M9培养基中培养用于进行3-HP生产测试的脱氮假单胞菌菌株。同时，通过在补充有25±2mmol/L3-HP的M9培养基中进行培养来制备用于进行3-HP降解测试的脱氮假单胞菌静息细胞。此处，3-HP浓度测量值的标准偏差计算为10％以下。符号：实心圆，3-HP；左半圆，细胞质量；十字，pH。图2示出3-HP的两条代谢途径(氧化途径和还原途径)。缩写：3-HPDH，3-羟基丙酸脱氢酶；3-HIBDH，3-羟基异丁酸脱氢酶；MMSADH，甲基丙二酸半醛脱氢酶；HPCS，3-羟基丙酰-CoA合成酶。图3示出了就3-羟基丙酸分解代谢物(catabolite)基因而言脱氮假单胞菌ATCC13867中的相对mRNA表达水平(A)以及倍数增加(B)。图3(A)示出了由在补充有25mmol/L3-HP的M9培养基中培养脱氮假单胞菌获得的结果(以灰色柱显示)和由在没有补充3-HP的M9培养基中培养脱氮假单胞菌获得的结果(以黑色柱显示)。图3(B)示出了取决于3-HP供给的mRNA表达水平差异的结果(以灰色柱显示)，其中结果以倍数增加进行表示。此处，mRNA水平测量值的标准偏差计算为10％以下。此处，使用rpoD基因作为参考基因来比较mRNA表达水平。图4示出了基因(即mmsadh(黑色显示)和3hibdhIV(灰色显示))的表达。除3-HP之外，3-羟基异丁酸(3HIB)、3-羟基丁酸(3-HB)、L-缬氨酸等也作为诱导物起作用。图5示出了基因3hpdH的表达。除3-HP之外，3HIB、3-HB、L-缬氨酸等也作为诱导物起作用。图6示出了启动子系统基因序列及其结构，该启动子系统由3-HP进行诱导。图6A示出了mmsadh基因和3hibdh基因以及调控mmsadh和3hibdh的基因转录的LysR蛋白(C4-LysR)基因的位置。图6B示出了3hpdh基因以及调控3hpdh的基因转录的LysR蛋白(C3-LysR)基因的位置。图7示出了C4-lysR基因的诱导型启动子的分析结果。基因(例如C4-LysR(由mmsR表示)和mmsadh(由mmsA表示))之间的O1操纵子和O2操纵子各自存在于相对于mmsadh转录起始位点(作为标准)的-58位置和-9位置处，并且各自包含反向重复序列。对构成O1和O2各自的反向重复序列进行分析的结果是，AACGTGTAA序列是保守的。图8示出了LysR家族转录调节因子的调控机制。图9示出了在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.针对3‑羟基丙酸(3‑HP)或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3‑HP或其衍生物具有反应性的LysR蛋白的结合位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.11 KR 10-2015-00825931.针对3-羟基丙酸(3-HP)或其衍生物的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含对3-HP或其衍生物具有反应性的LysR蛋白的结合位点。2.如权利要求1所述的诱导型启动子，其中，所述启动子来自具有3-HP降解性的微生物。3.如权利要求2所述的诱导型启动子，其中，所述微生物选自于由以下微生物所组成的组中的一种：脱氮无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)、燕麦食酸菌亚种(Acidovoraxavenaesubsp)、食酸菌属(Acidovoraxsp.)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophilia)、农杆菌属(Agrobacteriumsp.)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、红灯食烷菌(Alcanivoraxhongdengensis)、Alicycliphilusdenitrificans、海洋交替单胞菌(Alteromonasmarina)、拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)、Anaeromyxobacterdehalogenans、巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、印度拜耶林克氏菌(Beijerinckiaindica)、鸟博德特氏菌(Bordetellaavium)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、Burkholderiaambifaria、Catenulisporaacidiphilia、柄杆菌属(Caulobactersp.)、Castellanielladefragrans、紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)、Collimonasarenae、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)、Corynebacteriumvitaeruminis、Cupriavidusnecator、Curvibactergracilus、食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)、Ferrimonasbalearica、Glaciecolanitratireducens、支气管戈登菌(Gordoniabronchialis)、Hahellachijuensis、伸长盐单胞菌(Halomonaselongata)、Hirschialitorea、Idiomarinasp.、Janthinobacteriumlividum、刚毛北里孢菌(Kitasatosporasetae)、Kutzneriaalbida、甲基杆菌属(Methylobacteriumsp.)、甲基孢囊菌属(Methylocystissp.)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobiumsp.)、Oceanimonassmirnovii、副球菌属(Paracoccussp.)、Parvibaculumlavamentivorans、Phenylobacteriumkunshanensis、Photobacteriumgaetbuleda、Polynucleobacternecessariusasymbioticus、Pseudoalteromonascarrageenovora、Pseudogulbenkianiasp.、脱氮假单胞菌ATCC13867、P.knackmussii、P.protegens、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、Pseudoxanthomonasspadix、Psychrobacterphenylpyruvicus、Ralstoniaoxalatica、Rhodomicrobiumvannielli、Segniliparusrotundus、Shewanellaoneidensis、Simiduiaagarovorans、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、Sphingobiumchlorophenolicum、Sphingomonaswittichii、Sphingopyxisalaskensis、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、结节链霉菌(Streptomycesnodosus)、Tatlockiamicdadei、厦门海旋菌(Thalassospiraxiamenensis)、奇异贪噬菌(Variovoraxparadoxus)、Verminephrobactereiseniae、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)、自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)、Xanthomonascampestri以及水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)。4.如权利要求1所述的诱导型启动子，其中，所述LysR蛋白包含：具有螺旋-转角-螺旋结构并与DNA结合的N末端结构域、与3-HP或其衍生物结合的C末端结构域以及有助于稳定LysR蛋白二聚体的C末端结构域。5.如权利要求4所述的诱导型启动子，其中，所述具有螺旋-转角-螺旋结构并与DNA结合的N末端结构域包含由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2表示的氨基酸序列。6.如权利要求4所述的诱导型启动子，其中，所述与3-HP或其衍生物结合的C末端结构域包含由SEQIDNO：3表示的氨基酸序列。7.如权利要求4所述的诱导型启动子，其中，所述有助于稳定LysR蛋白二聚体的C末端结构域包含由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列。8.如权利要求1所述的诱导型启动子，其中，所述LysR蛋白的结合位点包含彼此结合的两个LysR蛋白二聚体。9.如权利要求1所述的诱导型启动子，其中，所述LysR蛋白的结合位点包含选自于SEQIDNO：5-SEQIDNO：43的碱基序列。10.如权利要求9所述的诱导型启动子，其中，所述LysR蛋白的结合位点包含重复两次的反向重复序列和与之配对的另一反向重复序列，其中所述反向重复序列包含选自于SEQIDNO：5-SEQIDNO：43的碱基序列。11.如权利要求10所述的诱导型启动子，其中，所述LysR蛋白的结合位点包含选自于SEQIDNO：44或SEQIDNO：45的碱基序列。12.如权利要求1所述的诱导型启动子，其中，所述衍生物为3-羟基异丁酸(3HIB)或3-羟基丁酸(3-HB)。13.包含如权利要求1-12任一项所述的诱导型启动子的重组表达载体。14.如权利要求13所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体进一步包含编码外源蛋白的基因，所述外源蛋白连接至针对3-羟基丙酸(3-HP)或其衍生物的所述诱导型启动子。15.如权利要求14所述的重组表达载体，所述外源蛋白为甘油脱水酶(DhaB)、DhaB再激活酶(GdrAB)或α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)。16.经如权利要求13所述的重组表达载体转化的重组微生物。17.如权利要求16所述的重组微生物，其中，所述重组微生物具有3-HP生产性。18.如权利要求17所述的重组微生物，其中，所述重组微生物是脱氮假单胞菌。19.如权利要求17所述的重组微生物，其中，所述重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴成勋，周生芳，索马孙达尔·阿肖克，薛恩姬，萨蒂夏·库马尔·艾纳拉，
申请(专利权)人：纳路涂料股份有限公司，纳路RC有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR