一种心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法及系统技术方案

本发明专利技术属于医药学技术领域，公开了一种心肌细胞缺氧‑复氧损伤的鉴定方法及系统，调控端粒酶线粒体转位，可以减轻线粒体损伤并改善心肌能量供应，从而起到心肌保护作用。本发明专利技术拟在原代培养乳鼠心肌细胞水平通过Shp‑2ShRNA干扰质粒和靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性和分布，分析线粒体损伤缓解状况；明确端粒酶线粒体转位与线粒体功能之间的关系，分析其减轻心肌缺氧/复氧损伤的可能机制，为以端粒酶为靶点的心肌保护治疗策略提供基础依据。

Identification method and system of myocardial cell anoxia reoxygenation injury

The invention belongs to the technical field of medicine and pharmacology, and discloses a method and system for identification of hypoxia injury of myocardial cells. The regulation of telomerase mitochondrial translocation can reduce mitochondrial damage and improve the energy supply of myocardium, thus protecting the myocardium. The present invention is intended to regulate the activity and distribution of telomerase by Shp 2ShRNA interference plasmid and target mitochondrial hTERT over expression in primary cultured neonatal rat cardiomyocytes, to analyze the remission status of mitochondria damage, and to clarify the relationship between telomerase mitochondrial translocation and mitochondrial function, and analyze its reduction of myocardial anoxia / reoxygenation injury. The mechanism provides a basis for the strategy of myocardial protection with telomerase as a target.

【技术实现步骤摘要】
一种心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法及系统
本专利技术属于医药学
，尤其涉及一种心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法及系统。
技术介绍
心血管疾病(cardiovasculardisease,CVD)是威胁全球人类健康的首要原因，而心肌缺血/再灌注损伤(myocardialischemialreperfusioninjury,MI/RI)被认为是CVD患者的主要危害因素之一，最终的结局均表现为炎症反应和心肌细胞凋亡，从而影响心肌功能。目前我国每年死于急性心肌梗死及其并发症的人数已经超过100万，且发病率一直呈明显上升趋势。新疆是多民族的聚居区，维吾尔族和哈萨克族占新疆总人口的50％以上。新疆是我国冠心病高发地区，维吾尔族冠心病的患病率为11.7％-14.8％，高于全国平均水平的3倍以上，哈萨克族高血压的患病率已超过40％，进入世界最高之列。因此，寻求有效可行的治疗措施，改善患者的预后，对提高各族人民健康水平具有重大的现实意义。如何才能减轻围术期的MI/RI，最大限度保护缺血心肌，降低围术期心脏不良事件是目前研究的热点。已经被证明部分麻醉药品发挥心肌保护是通过PI3-K/PI3K-Akt和ERK1/2信号的激活增强。这些药物激活信号通路的最终效应细胞器是线粒体，因此，对心肌的保护作用分子机制及其与线粒体的关系的研究具有重要意义。众所周知，线粒体是除细胞核外拥有DNA的细胞器之一，也是细胞呼吸和通过ATP产生能量的重要的细胞器，是细胞内活性氧簇(ROS)的主要来源，也是活性氧诱导的氧化损伤的主要目标。近几年研究发现氧化应激和药物治疗可导致端粒酶从细胞核转位到线粒体并保护线粒体功能。近年来有证据表明，线粒体定位的端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)可能发挥着与核内TERT完全不同的作用，端粒酶除有端粒保护作用外，还有促进细胞生存和抵抗应激的非端粒长度依赖性作用，主要为保护线粒体功能、调节细胞Ca2+内流、参与细胞因子调节、参与细胞信号转导及相关基因表达。同时，在TERT异位过度表达模型系统中，端粒酶不能保护在增加氧化应激时的端粒。端粒酶在细胞内不同亚细胞器之间动态穿梭，在增加氧化应激时端粒酶从核内转位，在细胞质(主要是线粒体)被发现，降低细胞应激水平可扭转端粒酶核外转位。因此，端粒酶在亚细胞器间穿梭是细胞内自然发生的和动态调节的。这个穿梭过程取决于各种因素，如细胞所处周期阶段、DNA损伤和氧化应激。另外，TERT线粒体转位过程与TERT自身酪氨酸磷酸化状态有关，酪氨酸激酶Src激酶家族以及酪氨酸磷酸酶Shp-2参与了TERT酪氨酸磷酸化改变过程。Ahmed等实验证明，过表达TERT的人纤维母细胞无论在急性还是慢性氧化应激条件下，都能降低线粒体内过氧化物的产量和维持其较低的细胞ROS水平，同时可以增强线粒体偶联，抑制线粒体功能障碍所致的逆行反应，保护并增强线粒体作用，抵制凋亡。Haendeler等进一步研究认为：TERT的这种保护作用在高呼吸频率组织中和几乎没有再生能力的组织中表现得更为明显，如心肌组织。另外，TERT可以减少胞浆中Ca2+的累积，增强线粒体对其的摄取能力，影响线粒体膜电位差的改变和ATP的合成。Ahmed等研究发现，TERT在应激条件下可以以一种时间和剂量依赖的方式可逆地从细胞核排出。在氧化应激条件下，端粒酶从核内排出，并且在TERT序列中发现了一个线粒体定位信号，它可以介导TERT进入并定位于线粒体，端粒酶被运送到线粒体基质后通过TOM与TIM结合到线粒体DNA编码的complexI，并增加complexI呼吸效率[7]。TERT可以在线粒体改变和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶激活之前，通过阻止细胞凋亡的级联反应来发挥其凋亡抑制作用。国内外研究证明：线粒体TERT能够不依赖于TERC模板、以线粒体tRNA为模板发挥反转录酶(RdDP)作用；线粒体TERT能与线粒体RNA内切核糖核酸酶的RNA部分(RMRP)结合，成为一种类似于RNA依赖的RNA多聚酶(RdRP)的复合物从而发挥转录后水平的基因沉默作用；线粒体TERT能够降低线粒体活性氧(ROS)水平，减轻线粒体DNA(mtDNA)损伤，抑制应激所诱导的凋亡过程，参与肿瘤细胞对化疗药物产生耐药；端粒酶具有明显的抗氧化应激和保护线粒体的功能在神经保护作用机制方面具有明显优势。有研究证明：TERT酪氨酸707位点是Shp-2磷酸酶作用的靶点。研究采用RNA干扰技术抑制酪氨酸磷酸酶Shp-2表达，结果氧化应激刺激能增加线粒体TERT表达；Src的酪氨酸激酶活性可能受到Shp-2的调控，两者共同调控应激状况下TERT酪氨酸磷酸化水平，TERT酪氨酸磷酸化水平增加能促进TERT的线粒体转位。综上所述，现有技术存在的问题是：心肌细胞发生缺血/再灌注损伤(I/RI)时产生一系列活性氧簇(ROS)，中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应破坏心肌细胞线粒体的完整性，影响心肌细胞的能量供给，这也是心血管病(CVD)患者围术期发生重大并发症的原因之一，但目前仍然缺乏有效的干预手段。而且现有技术没有从心肌细胞中端粒酶量及分布的变化对心肌具有怎样的影响；以及端粒酶量及分布的变化与线粒体之间有什么样的关系上进行分析心肌损伤的原因。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法及系统。本专利技术是这样实现的，一种心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法，包括：对原代培养乳鼠心肌细胞水平通过Shp-2ShRNA干扰质粒和靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性和分布，分析线粒体损伤缓解状况；分析端粒酶线粒体转位与线粒体功能之间的关系；并分析端粒酶减轻心肌缺氧/复氧损伤的机制。进一步，所述心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法具体包括：建立原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，在细胞水平上分析心肌细胞中端粒酶的含量与分布；通过Shp-2ShRNA干扰质粒及靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性及分布，影响心肌细胞线粒体能量供应，能否缓解乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤。进一步，建立原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的方法包括：原代乳鼠心肌细胞分离培养：健康新生1-3天SD大鼠，于无菌条件下取出心脏，分离心室肌，将组织剪为1×1×1mm的均匀碎块并使用D-Hank’s液冲洗；冲洗完毕后加入0.125％胰蛋白酶2ml，置于37℃水浴箱内进行消化，5min后弃去上清液；重复消化5次，分析组织状态，每次消化时间为5-8min；回收细胞悬液于离心管内，并加入适量10％胎牛血清+低糖DMEM培养液终止消化；收集细胞悬液于4℃下1000r/min离心5min，弃去上清液，10％胎牛血清+低糖DMEM培养液吹打离心管底部沉淀细胞，制备细胞悬液；将所述细胞悬液接种于培养皿内，置于37℃，5％CO2-95％O2培养箱中进行差速贴壁；2h后吸取细胞悬液接种于6孔板内，24h后分析细胞贴壁情况，并根据分组情况随机更换为低糖/高糖DMEM培养液；按所述消化过程对培养48h后的心肌细胞进行消化，调整细胞浓度为3×105个/ml，接种于35mm培养皿内，再培养24h后进行干预。进一步，所述通过Shp-2ShRNA干扰质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌细胞缺氧‑复氧损伤的鉴定方法，其特征在于，所述心肌细胞缺氧‑复氧损伤的鉴定方法包括：对原代培养乳鼠心肌细胞水平通过Shp‑2 ShRNA干扰质粒和靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性和分布，分析线粒体损伤缓解状况；分析端粒酶线粒体转位与线粒体功能之间的关系；并分析端粒酶减轻心肌缺氧/复氧损伤的机制。

【技术特征摘要】
1.一种心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法，其特征在于，所述心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法包括：对原代培养乳鼠心肌细胞水平通过Shp-2ShRNA干扰质粒和靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性和分布，分析线粒体损伤缓解状况；分析端粒酶线粒体转位与线粒体功能之间的关系；并分析端粒酶减轻心肌缺氧/复氧损伤的机制。2.如权利要求1所述的心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法，其特征在于，所述心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法具体包括：建立原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，在细胞水平上分析心肌细胞中端粒酶的含量与分布；通过Shp-2ShRNA干扰质粒及靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性及分布，分析影响心肌细胞线粒体能量供应，能否缓解乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤。3.如权利要求2所述的心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法，其特征在于，建立原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的方法包括：原代乳鼠心肌细胞分离培养：健康新生1-3天SD大鼠，于无菌条件下取出心脏，分离心室肌，将组织剪为1×1×1mm的均匀碎块并使用D-Hank’s液冲洗；冲洗完毕后加入0.125％胰蛋白酶2ml，置于37℃水浴箱内进行消化，5min后弃去上清液；重复消化5次，分析组织状态，每次消化时间为5-8min；回收细胞悬液于离心管内，并加入适量10％胎牛血清+低糖DMEM培养液终止消化；收集细胞悬液于4℃下1000r/min离心5min，弃去上清液，10％胎牛血清+低糖DMEM培养液吹打离心管底部沉淀细胞，制备细胞悬液；将所述细胞悬液接种于培养皿内，置于37℃，5％CO2-95％O2培养箱中进行差速贴壁；2h后吸取细胞悬液接种于6孔板内，24h后分析细胞贴壁情况，并根据分组情况随机更换为低糖/高糖DMEM培养液；按所述消化过程对培养48h后的心肌细胞进行消化，调整细胞浓度为3×105个/ml，接种于35mm培养皿内，再培养24h后进行干预。4.如权利要求2所述的心肌细胞缺氧-复氧损伤的鉴定方法，其特征在于，所述通过Shp-2ShRNA干扰质粒及靶向线粒体hTERT过表达调节端粒酶的活性及分布，分析影响心肌细胞线粒体能量供应，能否缓解乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤，具体包括：1)转染质粒的提取：采用EndoFreePlasmidMiniKitⅡ质粒提取试剂盒提取质粒；心肌细胞转染：转染前1d胰酶消化心肌细胞并计数；使胰酶消化心肌细胞贴壁时密度为60％～70％；按ShRNA转染试剂盒说明书进行转染；在37℃，5％CO2中孵育12h，更换为正常含血清培养基，48h后加入含5μg/ml杀稻瘟菌素的正常培养基，待大量未转染质粒的心肌细胞死亡后更换为含2.5μg/ml杀稻瘟菌素的正常培养基加压维持；慢病毒感染细胞：心肌细胞消化计数后铺6孔板，待70％融合后吸出原有培养基，以培养基稀释一定病毒量后加入各孔，在37℃，5％CO2中孵育24h，更换为正常含血清培养基；2)Shp-2ShRNA干扰效果和线粒体hTERT检测：总蛋白的提取：PBS漂洗三次后，按100ml培养液中加入200μlSDS裂解液工作液的比例加入，用细胞刮刮下细胞，置于冰上10～15min后移入1.5mlEP管中，(10000～14000)×g，4℃离心3～5min，取上清为提取的总蛋白；线粒体蛋白的提取：蛋白定量采用BCA蛋白定量试剂盒测定；Shp-2干扰效果的测定：配制8％SDS-PAGE凝胶，每组蛋白上样量为80μg，电泳，转膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h后，分别加入抗Shp-2一抗和抗β-actin一抗后4℃孵育过夜；洗膜后加入二抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永强，马岩，徐维昉，时娟，王江，
申请(专利权)人：新疆医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：新疆,65