锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5‑氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用，属于化疗药物技术领域。本发明专利技术为新药研发和创新疗法提供基础，适用于对人结直肠癌病人进行化疗，提高5‑氟尿嘧啶药物的化疗作用。

Application of zinc protoporphyrin in the preparation of 5- fluorouracil chemosensitivity drugs for enhancing human colorectal cancer cells

The invention discloses the application of zinc protoporphyrin in the preparation of enhanced human colorectal cancer cells to 5 chemosensitivity drugs of fluorouracil, which belongs to the field of chemotherapeutic drugs. The invention provides a foundation for new drug research and development and innovative therapy, and is suitable for chemotherapy of human colorectal cancer patients, and improves the chemotherapy effect of 5 fluorouracil.

【技术实现步骤摘要】
锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用
本专利技术涉及锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用，属于化疗药物

技术介绍
结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，据世界卫生组织国际癌症研究中心(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)资料显示，2012年全世界约有136万结直肠癌新发病例，居恶性肿瘤第3位，位于肺癌、乳腺癌之后；死亡约69万例，位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位。我国是结直肠癌的低发区，近年来，随着我国经济的发展、饮食结构和生活方式的改变，结直肠癌的发病率呈上升趋势。据统计截至2016年，我国结直肠癌新发病例数已达33.1万，其中死亡病例为15.9万。目前治疗主要是手术切除原发部位的肿瘤，术后辅以化疗、放疗、免疫治疗等多种手段对其进行辅助治疗，有效的化疗不仅可杀死残留癌细胞，也可预防癌细胞的进一步扩散和转移。通常的化疗方案是以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的联合化疗。
技术实现思路
本专利技术提供了锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种锌原卟啉(Zincprotoporphyrin，ZnPP)在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用。本专利技术以人结直肠癌RKO、HT29、HCT8细胞系为材料研究了血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)对5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及其可能的机制，专利技术人应用了不同浓度锌原卟啉(ZnPP)、钴原卟啉(CoPP)单独或联合5-FU作用于人结直肠癌细胞，AlaramBlue法观察药物对细胞生长抑制作用；定量PCR分析HO-1基因表达变化；流式细胞术检测细胞凋亡率；通过检测Caspase-3和活性氧(ROS)分析其可能的分子机制。结果显示：各类细胞均有HO-1表达，单用5-FU或5-FU联用CoPP后均能使其表达增强，但CoPP对其有诱导作用，5-FU联用ZnPP可降低HO-1的表达，且可明显抑制人结直肠癌细胞生长，呈剂量依赖性；5-FU联用ZnPP与单用5-FU相比，明显提高了细胞生长抑制率和凋亡率(P＜0.05)，5-FU联用CoPP则微弱的降低细胞生长抑制率和凋亡率(P>0.05)；单用5-FU与空白对照组比较，细胞内ROS活性明显增高，5-FU联用ZnPP后可进一步提高细胞内ROS活性(P＜0.05)，而联用CoPP能降低细胞内ROS活性水平(P＜0.05)。综上所述：专利技术人首次发现ZnPP能够增强人结直肠癌细胞对5-FU化疗敏感性，这一作用可能与增加细胞内ROS活性和细胞内Caspase-3活性有关。本专利技术为新药研发和创新疗法提供基础，本专利技术适用于对人结直肠癌病人进行化疗，提高5-氟尿嘧啶的化疗作用。附图说明图1为RKO细胞各处理组中RT-PCR分析HO-1基因表达情况；(A，HO-1；B，β-Actin；A和B中：M为MarkerDL2000；1为空白对照组；2为添加DMSO组；3为添加5-FU组；4为添加0.5μmolCoPP+5-FU组；5为添加1μmolCoPP+5-FU组；6为添加5μmolCoPP+5-FU组；7为添加10μmolCoPP+5-FU组；8为添加0.5μmolZnPP+5-FU组；9为添加1μmolZnPP+5-FU组；10为添加5μmolZnPP+5-FU组；11为添加10μmolZnPP+5-FU组)。图2为HCT8细胞各处理组中RT-PCR分析HO-1基因表达情况；(A，HO-1；B，β-Actin；A和B中：M为MarkerDL2000；1为空白对照组；2为添加DMSO组；3为添加5-FU组；4为添加0.5μmolCoPP+5-FU组；5为添加1μmolCoPP+5-FU组；6为添加5μmolCoPP+5-FU组；7为添加10μmolCoPP+5-FU组；8为添加0.5μmolZnPP+5-FU组；9为添加1μmolZnPP+5-FU组；10为添加5μmolZnPP+5-FU组；11为添加10μmolZnPP+5-FU组)。图3为HT29细胞各处理组中RT-PCR分析HO-1基因表达情况；(A，HO-1；B，β-Actin；A和B中：M为MarkerDL2000；1为空白对照组；2为添加DMSO组；3为添加5-FU组；4为添加0.5μmolCoPP+5-FU组；5为添加1μmolCoPP+5-FU组；6为添加5μmolCoPP+5-FU组；7为添加0.5μmolZnPP+5-FU组；8为添加1μmolZnPP+5-FU组；9为添加5μmolZnPP+5-FU组；)。图4为定量PCR法分析RKO细胞各处理组HO-1基因相对表达量。图5为定量PCR法分析HCT8细胞各处理组HO-1基因相对表达量。图6为定量PCR法分析HT29细胞各处理组HO-1基因相对表达量。图7为AlaramBlue法检测细胞抑制率。图8为HCT8细胞各处理组流式细胞仪检测细胞凋亡；(a,1μmolZnPP联合200μmol5-FU组；b,5μmolZnPP联合200μmol5-FU组；c,10μmolZnPP联合200μmol5-FU组；d,1μmolCoPP联合200μmol5-FU组；e,5μmolCoPP联合200μmol5-FU组；f,10μmolCoPP联合200μmol5-FU组；g,空白对照组；h,DMSO组；I,200μmol5-FU组。图9流式检测各处理组细胞凋亡比例。图10为各处理组对细胞ROS活性的影响。图11为各处理组对HCT8细胞Caspase-3活性的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。实施例1：1材料与方法1.1材料1.1.1试剂RKO细胞；HT29细胞；HCT8细胞等细胞由实验室保存；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、双抗、胎牛血清、AlaramBlue试剂盒购自lifetechnology公司；活性氧、Caspase3、细胞凋亡检测试剂盒、Bradford蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；HO-1和内参照β-actin引物交由上海英骏生物技术有限公司合成；RT-PCR试剂盒购自ThermoScientific公司。1.1.2仪器高压灭菌器(HVE-50，日本Hariyama公司)；双人单面净化工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司)；全功能微孔板检测仪(SYNERGY/H1，美国Biotek公司)；CO2培养箱(BB150，美国Thermo公司)；倒置显微镜(DMi8，德国LEICA公司)；离心机(5810R，德国Eppendorf公司)。1.2方法1.2.1细胞复苏、培养将装有HCT8、RKO、HT29细胞的冻存管从-80℃冰箱取出，套上薄膜手套，在37℃水浴锅内快速解冻，将解冻好的悬液转移至离心管，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞制悬液后转移至含完全培养液的培养皿内，放进CO2培养箱内培养。每天观察细胞，若细胞贴壁汇合度至80％，可用胰酶消化传代。1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5‑氟尿嘧啶化疗敏感性的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪亮亮，卢舜飞，张晓青，柯乐芹，
申请(专利权)人：丽水学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33