基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。该方法将植物内源油菜素内酯经过溶剂提取，提取液直接与硼亲和材料作用，内源油菜素内酯吸附于材料表面，经淋洗去除基质杂质后，再通过氧化－水解－反相洗脱的策略将吸附在硼亲和材料上的油菜素内酯洗脱而得。该方法操作简便，选择性好、回收率高，去除基质干扰彻底，可实现植物材料中痕量油菜素内酯类化合物的高灵敏度定量分析，在植物遗传学、作物科学等领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。
技术介绍
油菜素内酯(brassinosteroids，BRs)是一类重要的植物激素，在极低的浓度下参与调控植物的生长发育过程，包括调控花期、花粉发育、器官分化等；除了对生长发育的直接调控作用外，BRs还参与植物体对非生物、生物应激产生的应答，包括盐、干旱、极端温度等。内源BRs的准确定量分析对于研究BRs作用的分子机理具有重要的意义。但是由于BRs在植物中含量极低，并且植物基质复杂，高灵敏度BRs定量分析方法的建立一直是植物学家与分析化学家需要面对的难题。目前，由于其良好的分离能力和较高的灵敏度，LC-MS/MS技术成为BRs定量检测最主要的手段。LC-MS/MS技术的应用使BRs检测的灵敏度得到大幅度提高，但是仍不能满足一些极端条件下的需求，如一些珍稀突变体植物的特殊部位，样品量极少，难以收集足够量的样品，因此，改进BRs样品前处理方法成为解决这一问题的最佳选择。由于对BRs具有良好的选择性，硼亲和材料越来越多的被用于BRs的富集与纯化，硼亲和材料的应用有效地提高了前处理过程中对BRs的选择性，从而显著提高了BRs检测的灵敏度。但是，目前硼亲和材料纯化BRs的过程中通常存在以下问题：(1)需要与其他机理的固相萃取材料配合使用，一起用于BRs的除杂：如植物提取液一般需要先经过反相或者正相的固相萃取材料除杂，再与硼亲和材料作用；(2)植物提取液与硼亲和材料作用前需要除水：如植物材料冻干后提取、新鲜植物材料提取液吹干后再复溶、提取液中加入无水盐；(3)洗脱过程的回收率低：常用的洗脱体系包括酸性洗脱或者酯交换洗脱，效率较低；或者即使选择洗脱能力较强的氧化-水解体系洗脱，但是由于氧化-水解过程与洗脱过程同时进行，氧化-水解产生的硼酸残留会影响后续衍生化的效率，从而导致检测的灵敏度降低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。本专利技术提供的纯化内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：1)向植物原料中加入提取溶剂和油菜素内酯化合物的同位素内标，混匀进行提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a或b，得到结合物I；所述处理a为将所述提取液上样于装填有非磁性硼亲和材料的固相萃取柱；所述处理b为将所述提取液分散于非磁性硼亲和材料中；或者，向植物原料中加入提取溶剂、同位素内标和磁性硼亲和材料混匀后进行提取，得到结合物II；所述植物原料中含有油菜素内酯类化合物；2)将步骤1)所得结合物I或结合物II依次进行淋洗和氧化水解，去除氧化水解产物中的硼酸后，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到纯化产物。上述方法的步骤1)中，提取溶剂为质量百分浓度为60％-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为60％-100％的乙腈水溶液；所述甲醇水溶液的浓度具体可为90％；所述油菜素内酯类化合物具体为含有邻二醇基团的油菜素内酯类化合物；所述植物原料具体可为植物的叶片、茎、花、穗花、种子或果荚；所述植物具体可为水稻或拟南芥；所述植物原料的用量不超过100mg或不超过50mg或不超过10mg；具体可为2mg-100mg，具体可为2mg-50mg，更具体可为2mg-10mg；所述植物原料与提取溶剂的用量比为10mg：0.1-1mL；所述植物原料与硼亲和材料的用量比为10mg：1-100mg；所述非磁性硼亲和材料为表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料，粒径为50纳米至50微米级；；所述非磁性硼亲和材料具体可为BondElutPBA、Benzeneboronicacid，polymer-supported；上述两种材料均可购自Agilent；所述磁性硼亲和材料为超顺磁性的表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料；粒径为50纳米至5微米级；所述磁性硼亲和材料具体可为Poly(VPBA-co-EDMA)@Fe3O4)；所述提取步骤中，提取方法为各种常规方法，如超声、离心或磁分离等；当所用硼亲和材料为磁性硼亲和材料时，提取方法优选磁分离；处理a或b的目的是将提取液中的BRs萃取结合到磁性或非磁性硼亲和材料上。当所用硼亲和材料为磁性硼亲和材料时，硼亲和材料既可以萃取植物提取液中的BRs，也可以与植物材料、提取溶剂直接混合，故可同时进行溶剂提取和固相萃取；由步骤1)可知，该方法的样品前处理过程只需硼亲和材料这一种固相萃取材料进行纯化，无需与其他的固相萃取材料配合使用，并且硼亲和材料可以直接与新鲜植物样品或者新鲜植物提取液直接作用，无需将植物材料冻干或者复杂的除水步骤。所述步骤2)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂；具体选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液中的至少一种。该步骤的目的是为了尽可能除去以非硼亲和机理吸附的杂质。所述甲酸水溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；所述含甲酸的甲醇溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；所述含甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；所述淋洗具体为用质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗；所述步骤2)氧化水解步骤中，所述氧化水解可一步完成或先氧化后水解；所述氧化水解一步完成时，所用试剂为含有过氧化氢的氨水溶液；其中，过氧化氢含量为5-30％，具体为10％或15％或25％；氨含量为5-25％，具体为10％；所述氧化水解为先氧化后水解时，所用氧化试剂为过氧化氢的水溶液；所述过氧化氢的水溶液中，过氧化氢的质量百分浓度为5-30％，具体为10％；所用水解试剂为氨水溶液；所述氨水溶液中，氨含量为5-25％，具体为10％。所述步骤2)去除硼酸步骤为用水淋洗所述氧化水解步骤所得产物；所述用有机溶剂进行洗脱步骤中，有机溶剂为反相洗脱溶剂；具体选自质量百分浓度为80-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为80-100％的乙腈水溶液。另外，上述方法在油菜素内酯类化合物的定量分析中的应用，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了一种定量分析内源油菜素内酯类化合物的方法，该方法包括如下步骤：将前述方法所得纯化产物溶于溶剂中，再加入衍生化试剂进行硼酸基团与醇羟基的成酯反应，将所得衍生化产物进行LC-MS/MS检测。上述方法中，所述溶剂选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的至少一种；所述衍生化试剂为含有胺基或者季胺基的有机硼酸类化合物，具体选自6-甲氧基-3-吡啶硼酸(MPyBA)、3-(二甲氨基)-苯硼酸(DMAPBA)、4-(二甲氨基)-苯硼酸和2-溴吡啶-5-硼酸中的至少一种；所述衍生化步骤中，温度为10-60℃，具体为40℃；时间为0.1-2h，具体为1h。该衍生化的目的是为了提高BRs在检测时的质谱响应，以提高BRs检测的灵敏度。本专利技术提供的方法简单、快速、易操作，样品使用量较现有方法大大降低，因而显著提高了灵敏度。该方法对富集植物内源BRs表现出高选择性，能有效地去除植物提取液中的杂质，在10mg及以下鲜重植物材料中便可实现内源BRs的定量分析。附图说明图1为油菜素内酯标准品谱图。图2为本方法检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：1)向植物原料中加入提取溶剂和油菜素内酯化合物的同位素内标，混匀进行提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a或b，得到结合物I；所述处理a为将所述提取液上样于装填有非磁性硼亲和材料的固相萃取柱；所述处理b为将所述提取液分散于非磁性硼亲和材料中；或者，向植物原料中加入提取溶剂、同位素内标和磁性硼亲和材料混匀后进行提取，得到结合物II；所述植物原料中含有油菜素内酯类化合物；2)将步骤1)所得结合物I或结合物II依次进行淋洗和氧化水解，去除氧化水解产物中的硼酸后，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到纯化产物。

【技术特征摘要】
1.一种纯化内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：1)向植物原料中加入提取溶剂和油菜素内酯化合物的同位素内标，混匀进行提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a或b，得到结合物I；所述处理a为将所述提取液上样于装填有非磁性硼亲和材料的固相萃取柱；所述处理b为将所述提取液分散于非磁性硼亲和材料中；或者，向植物原料中加入提取溶剂、同位素内标和磁性硼亲和材料混匀后进行提取，得到结合物II；所述植物原料中含有油菜素内酯类化合物；2)将步骤1)所得结合物I或结合物II依次进行淋洗和氧化水解，去除氧化水解产物中的硼酸后，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到纯化产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，提取溶剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液；所述甲醇水溶液或乙腈水溶液的质量百分浓度具体为60％-100％；所述植物原料的用量不超过100mg或不超过50mg或不超过10mg；所述植物原料与提取溶剂的用量比为10mg：0.1-1mL；所述植物原料与硼亲和材料的用量比为10mg：1-100mg；所述非磁性硼亲和材料为表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料，粒径为50纳米至50微米级；所述磁性硼亲和材料为超顺磁性的表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料；粒径为50纳米至5微米级。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述淋洗溶剂选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、质量百分浓度为0.1-10％的甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液、质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛培勇，褚金芳，李兵兵，闫吉军，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11