一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素‑2标准样品的方法技术

本发明专利技术公开了一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素‑2标准样品的方法，包括下列步骤：1）大规模培养藻液破碎；2）毒素提取；3）葡聚糖凝胶色谱柱分离；4）扇贝毒素‑2高效液相色谱分离；5）扇贝毒素‑2高效液相色谱纯化；6）检验所述标准样品的均匀性和稳定性。本发明专利技术采用高效液相色谱法制备扇贝毒素‑2，前处理简单快捷，易于操作；收集方法简单；制备的标准样品均匀稳定，且纯度达90%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法
本专利技术涉及一种贝类毒素标准样品及其制备方法，具体的说，涉及一种从鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法，属于生物

技术介绍
扇贝毒素(Pectenotoxins,PTXs)是一类聚醚类大环内酯结构的脂溶性化合物，呈现7个小环醚结成的环状结构，在2004年柏林召开的海洋生物毒素会议上，FAO/IOC/WHO将其列为八大类海洋生物毒素中的一类。扇贝毒素-2(PTX2)是扇贝毒素类中最常见的的一种，化学式为C47H70O14，分子质量为859.07，[M+NH4]+：m/z876.5104。扇贝毒素-2主要由海洋甲藻中的鳍藻(Dinophysisspp.)产生，如鳍藻Dinophysisacuta，D.fortii，D.acuminata，D.caudata，D.norvegica，D.rotundata和D.infundibulus等，于1984年首次从日本的养殖扇贝Patinopectenyessoensis中鉴定发现，后在全球各地的贝肉和海水中广泛检出。研究发现这种毒素可导致小鼠腹腔注射高致死率，此外有研究发现其对几株人类肺癌细胞的具有潜在细胞毒性。因此，欧盟规定各种水产品的可食用组织中OA，DTXs和PTXs的含量总和不能超过160μg/kg，但包括中国在内的许多国家和地区尚没有专门针对PTXs毒素的检测规范和食用安全标准。目前尚未发现扇贝毒素-2的标准制备技术的报道，我国缺乏扇贝毒素的组分结构、分布规律的背景研究资料，国内检测海洋生物毒素的标准样品主要依赖从国外进口，其中加拿大国家研究委员会(NRC)下属的海洋生物科学研究所(IBM)提供的扇贝毒素的标准物质，已被包括我国在内的40多个国家的海产品和水质实验室采用。此外美国SIGMA公司也成功建立腹泻性贝类毒素OA的标准品制备工序。购买国外标准毒素价格昂贵且含量很少，但是国内的快速检测试剂开发需要大量标准品。总的来说，我国在海洋生物毒素标准品的研制方面鲜见报道，仅见有麻痹性海洋生物毒素标准样品制备专利1项。因此，为加强和建立我国贝毒流行病学管理系统、有效地预防和控制我国贝毒事件的发生，急需海洋生物毒素的标准物质制备技术。
技术实现思路
本专利技术针对当前市售扇贝毒素标准品的不足，所要解决的技术问题是：提供一种从大规模培养藻液中提取、分离纯化扇贝毒素-2的简单快捷，易于操作的高效液相制备技术方法。本专利技术还提供一种应用本方法制备的扇贝毒素-2的标准样品。本专利技术还提供该扇贝毒素-2标准样品的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供的大规模鳍藻培养藻液中扇贝毒素-2标准品的液相制备方法，采用如下技术方案：1)大规模培养藻液破碎：取前期培养的中国株鳍藻Dinophysisacuminata(DAYS01-E6,F2)的大规模培养液，过10～15μm滤膜后于-196℃左右液氮下冷冻。待冷冻完全后，再将其置于室温下解冻。待解冻完全再反复进行2次冻融。取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎。超声波细胞粉碎机的实验条件为：超声功率200～325W、超声频率为10～25kHz、总工作时间15～20min，超声波处理时样品温度15～30℃，仪器连续工作时间90～150min。优选的，为了提高藻液破碎效果，在培养液过10～15μm滤膜后中加入无机盐，加入无机盐的质量是培养液的3～10％，优选的无机盐是氯化钠。加入无机盐后再进行冷冻解冻，会大大提高藻细胞的破碎效果，且在后期萃取过程中能够去除。2)毒素提取：从藻液中提取毒素的方法是：取经过破碎处理的藻液(30mL)倒入分液漏斗，先用30～40mL乙醚萃取：再加30～40mL乙醚，进一步萃取，充分震荡后，静置5～10min,将水从下口放出，提取毒素的乙醚溶液从上口倒出。再用30～40mL二氯甲烷萃取两次，二氯甲烷萃取时，充分震荡后，静置5～10min,提取毒素的二氯甲烷从下口接出。使两相液层充分接触振荡操作：把分液漏斗倾斜，使漏斗的上口略朝下，倒置45°角，用力振荡的目的是使水与提取的有机溶剂充分混合。合并萃取液加入2～5g无水硫酸钠或无水硫酸镁除水，再除去干燥剂，35～40℃旋转蒸发浓缩，蒸去溶剂，甲醇溶解后，过0.22μm有机相滤膜备用。3)葡聚糖凝胶色谱柱分离：葡聚糖凝胶色谱柱采用SephadexLH20进行装填，凝胶预先甲醇活化，湿法装填入玻璃层析柱(60cm×1.2cm)。将经有机试剂提取后的扇贝毒素样品提取液(2～5mL)上柱后，以甲醇(200～250mL)洗脱，分段收集，每管收集液为6～8mL。每管取0.5～1mL于进样瓶中，进行HPLC-MS/MS分析。根据分析结果，选取含有扇贝毒素-2的组分(约为25～60管含有扇贝毒素-2组分)合并、浓缩，进行进一步的高效液相色谱的纯化。4)扇贝毒素-2高效液相色谱分离条件：采用高效液相色谱法探索最佳分离条件，确定最终优化条件为：色谱柱为C18分析色谱柱，流动相组成为A：纯水(含6.7mM氨水)；B：乙腈/水(90:10，v/v，含6.7mM氨水)，流速为1mL/min，柱温为40℃。确定样品中目标峰扇贝毒素-2的出峰时间，将优化后的色谱条件应用于液相制备，从而达到快速准确的分离目的。5)扇贝毒素-2高效液相色谱纯化：色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.8mm，粒度5μm；流动相：A：纯水(含6.7mM氨水)；B：色谱纯乙腈/水(90:10，v/v，含6.7mM氨水)；流速：1mL/min；柱温：40℃；检测波长：235nm；根据扇贝毒素-2的保留时间，收集目标色谱峰，将收集的组分利用旋转蒸发工艺去除试剂，即得扇贝毒素-2标准样品。6)检验所述标准样品的均匀性和稳定性。本专利技术的有益效果：本专利技术采用高效液相色谱法制备扇贝毒素-2，前处理简单快捷，易于操作；收集方法简单；制备的标准样品纯度达90％以上。附图说明图1扇贝毒素-2的化学结构式。图2本专利技术粗提液中毒素分析的LC-MS谱图。图3高效液相色谱串联紫外(HPLC-UV)检测的色谱图。图4本专利技术纯化后扇贝毒素-2的LC-MS谱图。具体实施方式下面结合实例及附图对本专利技术的技术方案进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的显著。实施例1本实施例提供的从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准品的方法，具体步骤如下：1)大规模培养藻液破碎：取前期培养的中国株鳍藻Dinophysisacuminata(DAYS01-E6,F2)的大规模培养液，过10～15μm滤膜后于-196℃左右液氮下冷冻。待冷冻完全后，再将其置于室温下解冻。待解冻完全再反复进行2次冻融。取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎。超声波细胞粉碎机的实验条件为：超声功率200～325W、超声频率为10～25kHz、总工作时间15～20min，超声波处理时样品温度15～30℃，仪器连续工作时间90～150min。在培养液过10～15μm滤膜后中加入无机盐，加入无机盐的质量是培养液的10％，本实施例的无机盐是氯化钠。加入无机盐后再进行冷冻解冻，会大大提高藻细胞的破碎效果，且在后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素‑2标准样品的方法，其特征在于，包括下列步骤：1）大规模培养藻液破碎：取中国株鳍藻的大规模培养液，过10~15μm滤膜后于‑196°C左右液氮下冷冻；待冷冻完全后，将其置于室温下解冻；解冻完全再反复进行2次冻融；取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎；2）毒素提取：取经过破碎处理的藻液，依次用乙醚和二氯甲烷各萃取两次，经旋转蒸发浓缩后，合并提取液，进行进一步分离与纯化；3)葡聚糖凝胶色谱柱分离：取经有机试剂提取后的扇贝毒素样品提取液，加入活化后的葡聚糖凝胶柱，以甲醇洗脱，分段收集；根据HPLC‑MS/MS分析结果，选取含有扇贝毒素‑2的组分合并、浓缩，进行进一步的高效液相色谱的纯化；4）扇贝毒素‑2高效液相色谱分析：采用高效液相色谱法的分离条件：采用C18色谱柱，流动相组成为A：纯水（含6.7mM氨水）；B：乙腈/水（90:10，v/v，含6.7mM氨水），流速为1mL/min，柱温为40°C；确定目标色谱峰；5）扇贝毒素‑2高效液相色谱制备：色谱柱： C18柱，长250mm，内径4.8mm，粒度5μm；流动相：A：纯水（含有6.7mM氨水）；B：色谱纯乙腈/水（90:10，v/v，含有6.7mM氨水）流速：1mL/min；柱温：40°C；检测波长:235nm；根据扇贝毒素‑2的保留时间进行收集；将收集的组分利用旋转蒸发工艺去除试剂，即得扇贝毒素‑2标准品。...

【技术特征摘要】
1.一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法，其特征在于，包括下列步骤：1）大规模培养藻液破碎：取中国株鳍藻的大规模培养液，过10~15μm滤膜后于-196°C左右液氮下冷冻；待冷冻完全后，将其置于室温下解冻；解冻完全再反复进行2次冻融；取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎；2）毒素提取：取经过破碎处理的藻液，依次用乙醚和二氯甲烷各萃取两次，经旋转蒸发浓缩后，合并提取液，进行进一步分离与纯化；3)葡聚糖凝胶色谱柱分离：取经有机试剂提取后的扇贝毒素样品提取液，加入活化后的葡聚糖凝胶柱，以甲醇洗脱，分段收集；根据HPLC-MS/MS分析结果，选取含有扇贝毒素-2的组分合并、浓缩，进行进一步的高效液相色谱的纯化；4）扇贝毒素-2高效液相色谱分析：采用高效液相色谱法的分离条件：采用C18色谱柱，流动相组成为A：纯水（含6.7mM氨水）；B：乙腈/水（90:10，v/v，含6.7mM氨水），流速为1mL/min，柱温为40°C；确定目标色谱峰；5）扇贝毒素-2高效液相色谱制备：色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.8mm，粒度5μm；流动相：A：纯水（含有6.7mM氨水）；B：色谱纯乙腈/...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟蒙蒙，谭志军，王玉，彭吉星，吴海燕，郭萌萌，付树林，翟毓秀，高寒，
申请(专利权)人：浙江大学，中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33