一种海葵神经毒素基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新的一种海葵神经毒素基因Ａｓ７，它是用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从侧花海葵触手总ＲＮＡ中分离得到的。本发明专利技术获得的重组海葵神经毒素具有生物活性，对大鼠离体心房具有强烈的促进收缩作用。本发明专利技术还公开了上述基因的表达及在制备治疗心血管疾病药物中的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因，特别是一种海葵神经毒素基因。本专利技术还涉及其蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
技术介绍
海葵(anthopleura)，属腔肠动物门(soelenterata)，珊瑚纲(anthozoa)，是海洋中较原始的动物类。在长期的生物进化过程中，为了抵御敌害及捕获食物，海葵触手的刺丝囊能够分泌多种海葵毒素，基本上是多肽类毒素，对人和动物有多种生理活性作用。根据海葵毒素的生理功能将其分为3类海葵神经毒素、海葵溶细胞素及海葵钾离子通道抑制剂。国外对海葵神经毒素的研究始于七十年代。1976年美国夏威夷大学Shibata等人从黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)中分离纯化了Ap-A和Ap-B二种毒素，发现有增强心肌收缩的作用；1977年，Tanaka等对Ap-A的氨基酸序列进行了测定；随后，又有多种海葵神经毒素被发现，并做了氨基酸序列测定，以及二级、三级结构的分析。1992年，Gallagher等根据天然的Ap-B的氨基酸序列，体外合成了编码Ap-B的基因，在大肠杆菌中进行了重组表达，重组蛋白与天然的Ap-B在氨基酸组成、序列、二级结构、高压液相图谱及生物活性方面相同。海葵神经毒素的药理研究结果显示，这类毒素专一地和钠离子通道膜蛋白3位点结合，能延迟钠通道的失活。一方面，毒素作为分子探针可用于钠通道的生物学研究；另一方面，毒素对心肌组织产生非常强的正性收缩作用，而且，对实验动物的心率和血压没有影响；另外，海葵毒素还具有抗心律失常的作用，它能够延长心肌细胞复极过程中的有效不应期和动作电位时程，属3类抗心律失常作用。因此，研究开发海葵神经毒素用于治疗心衰和心律失常，是一项很有意义的工作。海葵在我国海域分布较广，但产量较少。我国的海葵种类主要有黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)、纵条肌海葵(Haliplanella luciae)、日本侧花海葵(Anhopleura Japonica)、太平洋侧花海葵(Anthopleura pacfica)、暗侧花海葵(Anthopleura nigrescens)、青岛侧花海葵(Aanthopleura Qingdaoensis)、华丽黄海葵(anthopleura elegantissima)、须毛细指海葵(Metridium dianthus)、疣海葵(Adamsia palliata)、红海葵(Actinia equina)等。目前，国内对海葵神经毒素的研究报道较少。对我国特有的海葵资源进行研究，发现新的有应用前景的强心类及抗心律失常海葵毒素，进行基因重组、表达，具有很重要的意义。从所有已经纯化的海葵神经毒素一级结构来看，大部分为46～49个氨基酸，称为长链神经毒素，分子量在5kDa左右；另一些分子量在3kDa左右的多肽，称为短链神经毒素。目前文献报道的海葵长链神经毒素已有20多种，氨基酸序列比较可以看出其共性为存在6个Cys残基；3对二硫键；多肽链末端都是亲水性氨基酸。这些海葵神经毒素根据来源又可以分为两类来源于海葵科的Type-I类毒素称为海葵肽类毒素(Actiniid)；而来源于刺海葵科的Type-II类毒素称为刺海葵肽类毒素(Stichodactylid)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的海葵神经毒素基因。本专利技术的另一目的在于提供上述基因的蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。本专利技术所选择的海葵属于侧花海葵(anthopleura sp)，采自广东省湛江海边滩涂。侧花海葵毒素cDNA文库的构建首先分离海葵触手，提取总RNA。然后比较已发现的海葵神经毒素，它们的氨基酸组成及序列有很大的保守性，依据Ap-B两端的保守氨基酸序列，设计简并引物，运用RT-PCR方法，扩增得到目的条带，将目的条带连接到T载体，并转化E.coli挑选重组克隆。本专利技术通过对以上重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码侧花海葵毒素的克隆，命名为As7，并通过基因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码47个氨基酸的成熟肽，等电点为7.6，分子量为4,800道尔顿，具有典型的海葵神经毒素一级结构的特征，分子内含有6个半胱氨酸，形成3对二硫键。本专利技术通过设计了一对引物，将编码侧花海葵神经毒素的新基因As7用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pETTRX-As7)以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，As7融合蛋白的表达量可达到150mg/L，并且基本上处于可溶状态。本专利技术还优化了重组As7蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割和进一步的G50凝胶柱层析，可得到纯度在95％以上的成熟重组海葵神经毒素蛋白。本专利技术获得的重组海葵神经毒素具有生物活性。本专利技术获得的重组海葵神经毒素对大鼠离体心房具有强烈的促进收缩作用。对重组海葵神经毒素进行的活性实验，检测As7重组蛋白对大鼠离体心房的作用，发现用药后的大鼠心房收缩明显增强，最高可增强250.7％。此外，它还有3类抗心律失常作用，能够延长大鼠心肌细胞有效不应期17％。本专利技术利用基因工程的方法，找到了1个海葵毒素新基因，并采用融合表达系统生产出具有强心作用和抗心律失常作用的重组海葵毒素，可用于制备治疗心血管疾病药物。本专利技术的含有As7海葵神经毒素成熟肽编码序列的表达质粒pETTRX-As7由该表达质粒载体经Kpn I/Not I双酶切，可得到191bp的片段，即为侧花海葵神经毒素As7成熟肽编码序列(其中包含蛋白酶3C识别位点)。本专利技术的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。附图说明图1为海葵神经毒素基因As7核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；图2为海葵触手总RNA提取结果；图3为海葵神经毒素As7基因的RT-PCR扩增结果；图4为含基因As7的重组质粒pPETTRX-As7表达质粒构建图；图5为含基因As7的pPETTRX-As7表达质粒酶切鉴定图；图6为重组As7蛋白亲和层析图谱；图7为重组As7蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。图8为重组As7蛋白分子筛层析图谱。图9重组As7分子筛层析的SDS-PAGE(Tricine)分析图3中1PCR阴性对照；2PCR目的条带；3100bp DNA marker。图5中1100bp DNA marker；2pPETTRX-As7 Kpn I/Not I双切。图6中BB液洗脱；CC液洗脱；DD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海葵神经毒素基因Ａｓ７，来源于侧花海葵触手总ＲＮＡ，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增而得到的基因片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，刘文华，彭文烈，王义良，彭立胜，卫剑文，王磊，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]