基因输送载体及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于药物制剂研发领域，具体涉及一种基因输送载体及其制备与应用。所述基因输送载体，包括中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质、基因药物。本发明专利技术所构建的基因输送载体，在生理pH条件下粒径在50~500nm、分布均匀、表面电位在正负10mv之间，稳定性良好。更重要的是，所述基因输送载体对于基因药物特别是包括pDNA在内的需要输送至细胞核内发挥作用的DNA药物，具有很好的转染效果。

【技术实现步骤摘要】
基因输送载体及其制备与应用
本专利技术属于药物制剂研发领域，具体涉及一种基因输送载体及其制备与应用。
技术介绍
基因治疗是指将具有治疗意义的外源基因药物导入靶细胞用以纠正异常基因或者补偿缺失基因、使相应蛋白正常表达，从而达到治疗目的技术。基因治疗可用于有效治疗先天及后天性疾病，并且已在例如癌症、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、心脏病、传染病、囊泡性纤维症、X染色体相关重度免疫缺陷(X-linkedSCID)等疾病治疗中显示出其巨大的潜力。仅从理论上讲，基因治疗的概念并不难理解，即异常基因替换和缺失基因补偿；事实上，基因治疗存在着诸多亟待解决的难题，致使其临床应用发展受到阻碍。利用合适的载体将基因药物输送至靶细胞，突破基因药物面临的生物屏障，是基因治疗的关键环节。常见基因药物有小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)、质粒DNA(plasmidDNA,pDNA)、小发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)、反义寡核苷酸(anti-senseoligonucleotides,ODN)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)等。其中，siRNA是目前研究最多、应用最广的基因药物。siRNA是一类具有20～25个碱基对的双链RNA，可以与序列互补的目标mRNA相结合，促使mRNA的降解，从而影响相应蛋白的合成。shRNA是在siRNA的基础上发展起来的。siRNA的稳定性差，容易被RNA酶降解，shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，与RNA作用机制相同，都是通过RNA干扰效应实现靶基因的沉默。质粒DNA，即pDNA，是一类自然存在常见于细菌中的小型环状双链DNA分子，有时也见于古生菌和真核细胞中。质粒DNA常常承载着可能对生物体存活有利的基因序列，例如抗生素耐药性基因。pDNA常常被视作复制子，它可以在不同的宿主生物体中实现自主复制。在基因工程中，人工构建的质粒常常用作特殊基因的载体。pDNA在基因治疗中具有重要的研究潜力，经过改造的pDNA可用于实现细胞内缺失的蛋白在基因组水平上的补偿和纠正。近几年兴起的CRISPR/CAS9基因编辑技术也可以通过构建相应的pDNA实现由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因的修饰。基因药物的导入方法常分为三种：物理方法、病毒载体介导方法及非病毒载体介导方法。物理方法即是通过电穿孔、高压注射、磁转染、基因枪等方式将基因药物输送至靶细胞内。这些物理方法大都能够高效地实现基因药物直接进入细胞并实现表达，但是仍存在诸多问题，比如高压注射的方式能够高效地实现DNA在肝细胞中的表达，但是这一方法仅限于实验用小动物并未用于人体；电穿孔的方法已在体外及体内皮肤、肌肉、肿瘤等组织实现良好的转染效果，但是无法对人体内部组织进行有效的基因输送，且由于会有一定的电压刺激，极有可能引起的病人的不适应性及对组织器官的损伤，也可能会对基因组DNA的稳定性造成破坏。物理方法在实验用小动物上应用较多。病毒载体介导的基因输送具有高效、准确的特点，这是由病毒载体自身的感染机制决定的。目前，70%的基因治疗的临床试验都是使用经过改造的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒及腺相关病毒来输送基因药物。尽管病毒载体大大促进了基因治疗领域的发展，但是以病毒为载体进行基因治疗仍有很大的局限性，包括潜在的致瘤性、免疫原性及广泛的组织嗜性，并且该类型载体对DNA的装载能力较低且制备复杂。相比之下，非病毒载体应用于基因治疗能够解决病毒载体存在的局限，特别在安全性方面要远远优于病毒载体。尽管非病毒载体在靶向输送载体的能力上较病毒载体有所不足，但能够实现对基因药物的高效装载，制备也较为简单易行。在此基础上，非病毒载体受到研究者们的高度关注，包括脂质体、高聚物、聚合物泡囊、穿膜肽以及无机纳米粒子等在内的载体系统也成为基因治疗的研究热点。非病毒载体想要发挥作用，仅仅克服胞外屏障是不够的。载体还需要进入组织细胞内，实现溶酶体逃逸，才能将基因药物释放至细胞质中。对于siRNA、mRNA、miRNA等基因药物，只需要被释放至胞质中即可发挥作用；对于DNA类基因药物，除了要释放至细胞质中，还需要DNA通过核孔进入细胞核才能够实现表达。因此，寻找能够有效输送包括DNA类药物在内的基因药物的载体，是非常重要的。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基因输送载体其制备与应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种基因输送载体，包括中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质、基因药物。优选地，所述基因输送载体还包括靶向分子。进一步优选地，所述靶向分子与阳离子脂质的摩尔比例范围是1:(3～240)。优选地，所述中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质之间的摩尔比例范围是：(5～40)：(30～50)：(30～55)。优选地，中性脂质选自PC脂质。进一步优选地，所述PC脂质选自DSPC、DPPC、HSPC、DMPC、EPC。优选地，所述辅助脂质选自胆固醇和中链脂肪酸。进一步优选地，所述中链脂肪酸选用中链甘油三酯。优选地，所述阳离子脂质的pKa小于7.0。优选地，所述阳离子脂质包括4.0<pKa<7.0的阳离子脂质，所述4.0<pKa<7.0的阳离子脂质占阳离子脂质总数的摩尔比例范围是(5～90)％。优选地，所述阳离子脂质选自DLin-MC2-MPZ、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DOTAP、DOTMA、MVL5、DDAB、DC-Chol、DOSPA、DOGS。优选地，所述阳离子脂质与基因药物之间的N/P比范围是(1～10)：1。优选地，所述基因输送载体还包括聚乙二醇化脂质PEG-lipids。优选地，所述PEG-lipids与阳离子脂质之间的摩尔比例范围是1：(3～110)。进一步优选地，所述PEG-lipids选自PEG-DSPE、PEG-S-DSG、PEG-C-DSA、PEG-S-DSA、PEG-C-DOMG、PEG-C-DMA、PEG–S-DPG、PEG–S-DMG、PEG-CerC8、PEG-CerC14、PEG-CerC20。进一步优选地，所述PEG-lipids中PEG的分子量范围是200～5000。更优选，PEG的分子量范围是2000。优选地，当所述基因输送载体中，同时包括靶向分子和PEG-lipids时，所述PEG-lipids与所述靶向分子与之间的摩尔比例范围是(1～80)：1。本专利技术一实施例中，所述靶向分子选用R-Spondin1蛋白(以下简称RSPO1)。本专利技术的又一实施例中，所述靶向分子选用ScFv蛋白。本专利技术的第二方面提供了前述包括靶向分子的基因输送载体的制备方法，所述方法选自以下方法之任一：方法一、包括步骤：(1)按配比取中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质、PEG-lipids、DSPE-PEG2000(Maleimide)的乙醇储备液，混合，将混合后的混合脂质乙醇溶液注入缓冲溶液中，得空白阳离子脂质体；(2)按照阳离子脂质与基因药物的N/P比，将基因药物注入到步骤(1)所得空白阳离子脂质体中，得脂质体-基因复合物；(3)将步骤(2)所得脂质体-基因复合物，于缓冲液中透析，去除乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因输送载体，包括中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质、基因药物。

【技术特征摘要】
1.一种基因输送载体，包括中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质、基因药物。2.根据权利要求1所述的基因输送载体，其特征在于，所述基因输送载体还包括靶向分子。3.根据权利要求2所述的基因输送载体，其特征在于，所述靶向分子与阳离子脂质的摩尔比例范围是1:(3～240)。4.根据权利要求1～3任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述中性脂质、辅助脂质、阳离子脂质之间的摩尔比例范围是：(5～40)：(30～50)：(30～55)。5.根据权利要求1～3任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述辅助脂质选自胆固醇和中链脂肪酸。6.根据权利要求1～3任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述阳离子脂质的pKa的范围是小于7.0。7.根据权利要求1～3任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述阳离子脂质包括4.0<pKa<7.0的阳离子脂质，所述4.0<pKa<7.0的阳离子脂质占阳离子脂质总数的摩尔比例范围是(5～90)％。8.根据权利要求1～3任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述阳离子脂质与基因药物之间的N/P比范围是(1～10)：1。9.根据权利要求1～8任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述基因输送载体还包括聚乙二醇化脂质PEG-lipids。10.根据权利要求9所述的基因输送载体，其特征在于，所述PEG-lipids与阳离子脂质之间的摩尔比例范围是1：(3～110)。11.根据权利要求9所述的基因输送载体，其特征在于，所述PEG-lipids中PEG的分子量范围是200～5000。12.根据权利要求9～11任一权利要求所述的基因输送载体，其特征在于，所述PEG-li...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宇虹，张琰，曹婧，魏晓慧，许风伟，魏爽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31