本发明专利技术涉及菌株领域，具体涉及一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP‑5菌株培养和应用。通过对菌种培养条件的筛选和优化，筛选出简便易行且可靠的培养条件，使其能在一般环境中生存，降低对工艺的要求，改良菌种培养条件。采用微胶囊技术，采用试管斜面保存法和菌液低温保存法，保护沙雷氏菌。利用不同菌株对根结线虫的特异性杀灭机理和对土壤生态的改良作用，共生发酵，协同作用法。本发明专利技术的目的在于提供性质稳定的沙雷氏菌PFMP‑5的新菌株，它能够在短时间内产生大量的灵菌红素。该色素对蔬菜根结线虫有很强的杀灭作用。
【技术实现步骤摘要】
一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养和应用
本专利技术涉及菌株领域，具体涉及一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养方法和应用。
技术介绍
根结线虫是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。已知为害蔬菜的线虫主要有高弓根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫以及甜菜根结线虫等。线虫寄主范围广泛，常为害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、葫萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害。我国的生物防治研究起步较晚，蔬菜病害防治上使用普遍的生防制剂局限于阿维菌素、淡紫拟青霉、枯草芽孢杆菌和少数真菌。其中，荧光假单胞菌是最常见的一种生防制剂，它能够分解一种蛋白酶，可以在较短时间内分解线虫体壁，引起其体液的渗漏。达到防治根结线虫病害的目的(路平.根结线虫生防细菌的筛选鉴定及其应用研究[D].山西农业大学,2016)。但是，近几年，随着生产菌株传代增加，菌株退化严重，目前效价只有2000～2400μg/ml，培养时间也明显增加，后处理的成本增加且耗能、费时。过高生产成本的严重影响荧光假单胞菌的产业化生产。相关文献提及到沙雷氏PFMP-5菌所产生的灵菌红素已被证明具有很强的抗癌活性，但是植物病害防治方面具体的文献很少。
技术实现思路
针对上述问题，通过实验证明，此菌株所产生的灵菌红素对线虫有很强的杀灭能力，确实有较好的防效，再深入研究发现此菌所产灵菌红素起到杀灭蔬菜根结线虫作用的有效物质。但是由于无法规模化生产而研究进展缓慢。本专利技术的目的在于提供性质稳定的沙雷氏菌PFMP-5的培养方法和应用，通过优化发酵培养基的营养成分以及营养成分的配比，降低沙雷氏菌PFMP-5生产成本和能耗，短时间内产生大量的灵菌红素，实现规模化生产。进一步提高防治蔬菜大棚根结线虫病害的效果。本专利技术的沙雷氏菌PFMP-5菌株一般通过细菌接种和恒温培养获得。该菌能产生灵菌红素。本专利技术的一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养方法和应用，所述菌株为沙雷氏PFMP-5菌株，包括培养方法如下步骤：步骤1：斜面培养：将沙雷氏菌PFMP-5的原始菌种在无菌条件下接种于固体培养基，在26～30℃条件下培养1-2天；步骤2：一级种子培养：将步骤1培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在26～30℃条件下，180r/min摇床培养2-3天，制得一级种子，结束培养时菌悬液光密度OD600值均达到3.5；步骤3：二级种子培养：按液体培养基的体积比为5％的接种量，将步骤2培养的一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，在26～30℃条件下，搅拌速度为180r/min，通气量为1：0.5，培养3-5天，制得二级种子；步骤4：混合发酵培养：按液体培养基的体积比为20％的接种量，将步骤3培养的二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂；发酵培养过程包括：b、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1，调控发酵溶解氧5％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，温度30℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：72小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，使用碳酸钙调节稳定pH＝7.0，温度30℃。固体培养基的制备：蛋白胨5g，蔗糖10g，牛肉膏3g，蔗糖10g，琼脂粉17g，NaCl0.5％，pH＝7.0，水1000ml，将制成的液体发酵培养基分别装入三角瓶中150ml/瓶，然后将培养基放入高压灭菌锅115℃灭菌30min。待三角瓶中培养液降至室温且未开始凝固时均匀地倒入平板内，待其自然凝固可用。液体培养基的制备：蛋白胨5g，蔗糖10g，牛肉膏3g，蔗糖10g，NaCl0.5％，pH＝7.0，水1000ml，将制成的液体发酵培养基分别装入三角瓶中150ml/瓶，然后将培养基放入高压灭菌锅115℃灭菌30min。用划线法将菌种接种至固体培养基，置入28℃恒温培养箱中培养24小时左右。然后转移至4℃冰箱备用。待液体培养基冷却后将平板固体培养基中沙雷氏菌的菌落用接菌环接入三角瓶，置入通风摇床中，在28℃、180r/min条件下培养48小时以上，用雪球计数器测得其细菌数量约为5.3×108cfu·ml-1。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养方法和应用，通过对菌种培养条件的筛选和优化，筛选出简便易行且可靠的培养条件，使其能在一般环境中生存，降低对工艺的要求，改良菌种培养条件。采用微胶囊技术，保护沙雷氏菌，减少损伤。此外还采用试管斜面保存法和菌液低温保存法，更有利于沙雷氏菌的培养。利用不同菌株对根结线虫的特异性杀灭机理和对土壤生态的改良作用，共生发酵，协同作用法。本专利技术提供的一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养方法和应用，采用常规培养基和培养条件下，效价可达5000ug/ml；采用本专利技术的菌株发酵生产技术，可以用于生物农药沙雷氏菌的工厂化生产，采用该方法生产沙雷氏菌PFMP-5的新菌株杀线虫剂发酵液浓缩倍数2－3倍，可达效价10000ug/mL。在相同发酵罐和发酵条件下，比原有方法产品产量提高，节约成本，防病效果提高。综上所述，本专利技术提供了一种沙雷氏菌PFMP-5在蔬菜根结线虫病害上的应用以及能够高产、节本、增效，可实现大规模生产的发酵培养生产技术，对于实现我国自主创新生物农药产业化发展，扩大使用范围，促进农业可持续发展有着主要意义。附图说明图1为1h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图2为6h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图3为12h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图4为18h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图5为24h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图6为48h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图7为72h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图；图8为96h电镜下观察的沙雷氏菌PFMP-5对根结线虫的侵染状态图。具体实施方式为了更好地解释本专利技术，以下结合具体实施例进一步阐明本专利技术的主要内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于以下实施例。本专利技术在研究一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养和应用，为研发沙雷氏PFMP-5菌株防治蔬菜根结线虫病害提供理论依据。下面为上述培养方法进行的试验：1、试验材料实验菌株：嗜线虫沙雷氏菌属编号为PFMP-5菌株，由本实验室冷冻保藏；供试线虫：实验室原有的分离出来的根结线虫。2、主要的仪器和设备离心管，蒸馏瓶，移液枪，小烧杯，量筒，，IKA旋转蒸发仪，高速台式冷冻离心机(型号：SorvallST16RCentrifuge厂家：ThermoFisher)，磁力搅拌器(型号：GL-3250B厂家：海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；显微镜，贝氏小皿，移液枪，量筒，解剖镜，毛针，二甲基亚砜，0.01％吐温80，无菌双蒸水，灵菌红素，电热恒温培养箱(型号：HH.B11.420-BS-Ⅱ厂家：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP‑5菌株培养和应用，其特征在于，所述沙雷氏PFMP‑5菌株的培养方法包括如下步骤：步骤1：斜面培养：将沙雷氏菌PFMP‑5的原始菌种在无菌条件下接种于固体培养基，在26~30℃条件下培养1‑2天；步骤2：一级种子培养：将步骤1培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在26~30℃条件下，180 r/min摇床培养2‑3天，制得一级种子，结束培养时菌悬液光密度OD
【技术特征摘要】
1.一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养和应用，其特征在于，所述沙雷氏PFMP-5菌株的培养方法包括如下步骤：步骤1：斜面培养：将沙雷氏菌PFMP-5的原始菌种在无菌条件下接种于固体培养基，在26~30℃条件下培养1-2天；步骤2：一级种子培养：将步骤1培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在26~30℃条件下，180r/min摇床培养2-3天，制得一级种子，结束培养时菌悬液光密度OD600值均达到3.5；步骤3：二级种子培养：按液体培养基的体积比为5%的接种量，将步骤2培养的一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，在26~30℃条件下，搅拌速度为180r/min，通气量为1：0.5，培养3-5天，制得二级种子；步骤4：混合发酵培养：按液体培养基的体积比为20%的接种量，将步骤3培养的二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂；一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株，其特征在于：由权利要求书1所述的沙雷氏PFMP-5菌株的培养方法培养获得。2.如权利要求1所述的一种防治蔬菜根结线虫病害的沙雷氏PFMP-5菌株培养和应用，其特征在于：所述发酵培养过程包括：有氧培养阶段：起始0~24小时内，间...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁磊，
申请(专利权)人：丁磊，
类型：发明
国别省市：山西,14
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