一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法技术

一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，属于生物工程领域。该方法包括步骤：(1)利用克隆的粘合域与纤维素结合域构建长度可控的重组支架蛋白；(2)构建含有锚定域的固定化蛋白，通过锚定域与粘连域之间的生物亲和作用实现该蛋白质与支架蛋白的特异性吸附；(3)利用纤维素结合域与纤维素亲和作用实现单一纤维素表面的蛋白质复合体多层、定向、比例可控式自组装。本发明专利技术所具有的优点在于：实现了蛋白质的精确定向化，保证该蛋白活性中心在固定化之后的完整性；通过支架蛋白不仅可以大量地提高固定化蛋白质的数量，而且能够通过调控支架长度来改变固定化蛋白质的数量，这为构建高效率、低成本的多蛋白复合体催化体系提供了一种可行的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于锚定-粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法。
技术介绍
天然酶是生产实践中最高效的温和催化剂，对人们的日常生活具有非常重要的意义。当天然酶被提取出来应用于生产实践中时，它的稳定性变差导致容易失活，而且不能够再重复利用。因此人们将酶在载体表面进行固定化，这样可以克服天然酶存在的不足，还保留天然酶的高效性、高选择性等优点，有利于工业生产中的连续操作。因此固定化酶技术成为酶工程研究领域中的热点和重点对象。目前传统固定化酶技术已经有了重大突破以及取得了很多的重要的成果，然而在传统常见的固定化酶技术中酶分子一般是多个位点与载体进行结合，这样很容易导致酶分子的催化活性中心被载体阻挡，同时固定化酶的数量少，这些最终导致酶催化活性效率下降。为了克服存在的这种问题，越来越多的人开始探索研究新的固定化方法和寻找新的固定化载体，尽可能保证固定化酶的催化活性中心不受破坏，同时提高固定酶的数量。纤维素是自然界中最为丰富的、可再生的天然高分子聚合物，其中微晶纤维素由于具有高稳定性、比表面积大、生物安全性好、价格便宜等特点成为了一种性能优良的生物材料，因此对纤维素的高附加值利用已经变成了一个研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有固定化技术存在的固定化酶数量少和固定化酶蛋白分子活性中心被隐藏等不足，通过基因工程技术手段改造固定化蛋白质使其按照同一方向固定在纤维素表面，保证该蛋白活性中心在固定化之后的完整性。在本专利技术中引入支架蛋白作为载体与固定化蛋白之间的桥梁，通过控制支架蛋白长度来间接调控固定蛋白质的数量，最终实现蛋白质多层定向固定化。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：1、一种基于锚定-粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)支架蛋白与固定化蛋白质的结构设计、分子改造和生物制备，具体包括：①支架蛋白与固定化蛋白质的结构和功能设计：支架蛋白由1-12个粘合域结构组成而且没有催化活性；固定化蛋白质碳末端添加锚定域结构，使得能够亲和识别粘合域。②锚定域基因与粘合域基因的分子克隆。③拼接1-12个不同数量的锚定域基因构成了不同长度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纤维素结合域CBM基因和氮末端添加组氨酸标签，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞内表达验证以及支架蛋白的分离纯化。⑤固定化蛋白质的基因修饰，即在该蛋白氮末端插入锚定域基因构建新的融合蛋白，为了保证该融合蛋白的可溶性表达因此在固定化蛋白和锚定域中间插入GS-Linker短肽，最后是固定化蛋白质的微生物胞外分泌表达以及其验证该融合蛋白是否与支架蛋白发生特异性亲和吸附作用。(2)固定化前对载体进行表面封闭处理，目的是封闭载体表面微孔隙防止支架蛋白的非特异性吸附。具体操作是将载体分散在质量浓度为1％牛血清蛋白溶液中，在20℃条件下振荡1h，然后离心除去上清液，并用pH 8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。(3)支架蛋白与载体的亲和吸附，形成载体-支架蛋白自组装体。具体操作是将表达纯化后不同长度的支架蛋白与封闭处理后的载体在20℃条件下进行振荡混合12h，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。(4)固定化蛋白与载体-支架蛋白的亲和固定吸附，最终进行多蛋白的自组装体系。具体操作是将载体-支架蛋白与表达纯化后的固定化蛋白质在4℃条件下进行振荡混合12h，并且添加终浓度为10mM的氯化钙促进固定化蛋白质的吸附，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。进一步，所述步骤(1)中支架蛋白由纤维素结合域CBM和粘合域组成，而且该支架蛋白长度范围为1-12个粘合域。进一步，所述步骤(1)中固定化蛋白质基因后面连接锚定域，而且该蛋白基因与锚定域中间由基因长度为21pb的GS-linker短肽连接。进一步，所述步骤(1)中支架蛋白与固定化蛋白均带有组氨酸标签，通过蛋白的组氨酸标签与金属镍进行亲和吸附作用除去杂蛋白。进一步，所述步骤(2)中的载体材料为纤维素。进一步，所述步骤(3)中支架蛋白与载体进行反应的固液质量比为1:20，固定化温度为20℃。进一步，所述步骤(4)中固定化蛋白与载体的固液质量比为1:40，固定化温度为4℃，而且必须要添加终浓度10mM的氯化钙促进固定化吸附作用。在本专利技术的一方面，提供一种支架蛋白的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)种属和类型特异性的锚定域基因与粘合域基因的分子克隆(2)不同长度支架蛋白的粘合域基因之间柔性分子拼接(3)碳端引入纤维素结合域，氮端添加组氨酸标签(4)支架蛋白的可溶性胞内表达以及分离纯化步骤(1)具体为：粘合域与纤维结合域基因原始序列来源于热纤梭菌，因此设计引物以该模板进行PCR扩增获得粘合域与纤维素结合域构基因。步骤(2)具体为：通过双酶切手段把扩增获得的粘合域基因有序的进行不同长度的拼接，插入到pET22b质粒中。步骤(3)具体为：通过酶切手段在该支架蛋白的碳端插入纤维素结合域，同时在氮端添加了组氨酸标签。步骤(4)具体为：将构建完毕的pET22b质粒导入到BL21中进行蛋白的可溶性验证，利用组氨酸标签对该蛋白进行纯化。在本专利技术的另一方面，提供一种固定化蛋白的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)种属和类型特异性的锚定域基因的分子克隆(2)固定化蛋白基因与特定锚定域基因的柔性分子对接(3)固定化蛋白氮端引入基因长度为21pb的GS-Linker短肽(4)固定化蛋白的可溶性表达以及分离纯化步骤(1)具体为：锚定域基因原始序列来源于热纤梭菌，因此设计引物以该模板进行PCR扩增获得锚定域基因。步骤(2)具体为：将扩增的锚定域基因插入到PYD质粒的GS-Linker短肽后面，然后接着在GS-Linker短肽前面插入固定化蛋白质基因，最后将这构建的所有基因进行PCR扩增，插入到PETDuet质粒中。步骤(3)具体为：将构建完毕的PETDuet质粒导入到BL21中进行蛋白的可溶性验证，利用组氨酸标签对该蛋白进行纯化。本专利技术的有益效果：本课题借助基因重组技术手段，构建了一套完整的多层定向自主装固定化蛋白体系，体系中引入支架蛋白作为固定载体与固定目标蛋白之间的桥梁，这样提高了固定化蛋白复合体系的生物相容性，一方面可以使得支架蛋白与固定化蛋白质特异性定向结合，从而克服了传统固定化蛋白中催化活性位点被隐藏的缺点，另一方面通过可控性调节支架蛋白的长短来间接控制固定目标蛋白的数量，这种方法固定的蛋白质数量远远大于传统单层固定化蛋白的数量。附图说明图1支架蛋白发酵液蛋白电泳图图2支架蛋白发酵液纯化后蛋白电泳图图3绿色荧光蛋白GFP纯化后蛋白电泳图图4纤维素吸附支架蛋白及GFP复合体电泳图图5固定化载体纤维素荧光显微镜图片具体实施方式以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆：实验室操作手册中所述的条件或者按照说明书所建议的条件。实施例1支架蛋白的制备一、支架蛋白质粒材料：用于克隆的大肠杆菌为E.coli TOP10，用于目的基因表达菌株为E.coli BL21(DE3)，均从天根生化科技(北京)有限公司购买。二、支架蛋白表达质粒的构建：根据已知粘合域基因序列，用合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)支架蛋白与固定化蛋白质的结构设计、分子改造和生物制备，具体包括：①支架蛋白与固定化蛋白质的结构和功能设计：支架蛋白由1‑12个粘合域结构组成而且没有催化活性；固定化蛋白质碳末端添加锚定域结构，使得能够亲和识别粘合域。②锚定域基因与粘合域基因的分子克隆。③拼接1‑12个不同数量的锚定域基因构成了不同长度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纤维素结合域CBM基因和氮末端添加组氨酸标签，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞内表达验证以及支架蛋白的分离纯化。⑤固定化蛋白质的基因修饰，即在该蛋白氮末端插入锚定域基因构建新的融合蛋白，为了保证该融合蛋白的可溶性表达因此在固定化蛋白和锚定域中间插入GS‑Linker短肽，最后是固定化蛋白质的微生物胞外分泌表达以及其验证该融合蛋白是否与支架蛋白发生特异性亲和吸附作用。(2)固定化前对载体进行表面封闭处理，目的是封闭载体表面微孔隙防止支架蛋白的非特异性吸附。具体操作是将载体分散在质量浓度为1％牛血清蛋白溶液中，在20℃条件下振荡1h，然后离心除去上清液，并用pH 8.0Tris‑Hcl缓冲液洗涤三次。(3)支架蛋白与载体的亲和吸附，形成载体‑支架蛋白自组装体。具体操作是将表达纯化后不同长度的支架蛋白与封闭处理后的载体在20℃条件下进行振荡混合12h，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris‑Hcl缓冲液洗涤三次。(4)固定化蛋白与载体‑支架蛋白的亲和固定吸附，最终进行多蛋白的自组装体系。具体操作是将载体‑支架蛋白与表达纯化后的固定化蛋白质在4℃条件下进行振荡混合12h，并且添加终浓度为10mM的氯化钙促进固定化蛋白质的吸附，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris‑Hcl缓冲液洗涤三次。...

【技术特征摘要】
1.一种基于锚定-粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)支架蛋白与固定化蛋白质的结构设计、分子改造和生物制备，具体包括：①支架蛋白与固定化蛋白质的结构和功能设计：支架蛋白由1-12个粘合域结构组成而且没有催化活性；固定化蛋白质碳末端添加锚定域结构，使得能够亲和识别粘合域。②锚定域基因与粘合域基因的分子克隆。③拼接1-12个不同数量的锚定域基因构成了不同长度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纤维素结合域CBM基因和氮末端添加组氨酸标签，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞内表达验证以及支架蛋白的分离纯化。⑤固定化蛋白质的基因修饰，即在该蛋白氮末端插入锚定域基因构建新的融合蛋白，为了保证该融合蛋白的可溶性表达因此在固定化蛋白和锚定域中间插入GS-Linker短肽，最后是固定化蛋白质的微生物胞外分泌表达以及其验证该融合蛋白是否与支架蛋白发生特异性亲和吸附作用。(2)固定化前对载体进行表面封闭处理，目的是封闭载体表面微孔隙防止支架蛋白的非特异性吸附。具体操作是将载体分散在质量浓度为1％牛血清蛋白溶液中，在20℃条件下振荡1h，然后离心除去上清液，并用pH 8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。(3)支架蛋白与载体的亲和吸附，形成载体-支架蛋白自组装体。具体操作是将表达纯化后不同长度的支架蛋白与封闭处理后的载体在20℃条件下进行振荡混合12h，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：范立海，黎梅，岳艺，王在宇，谭天伟，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11