从溶液去除乳糖的方法技术

本发明专利技术提供了蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其包含已经固定了结合乳糖的蛋白质或酶的磁性纳米颗粒(MNP)。该蛋白质功能化的磁性纳米颗粒尤其适合从包含乳糖的溶液，例如牛奶、奶酪、酸奶、风味乳等分离乳糖。可将该蛋白质功能化的MNP添加至包含乳糖的溶液并结合溶液中的乳糖。然后，可通过例如施加外部磁场，从溶液磁力去除结合了乳糖的MNP。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的引用本申请要求南非临时专利申请号2014/00633的优先权，其通过引用并入本文。
本专利技术涉及利用结合乳糖的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒和磁场从溶液，比如牛奶分离乳糖的方法。
技术介绍
乳糖不耐症(也被称为肠乳糖酶缺乏)是一种影响大约70％的世界人口的病况，其症状包括胃气胀、气胀和腹泻。这是由于乳糖酶下调而造成不能消化乳糖引起的。因此，乳糖不能被身体消化并且进入到结肠并在那里被肠道细菌发酵而产生脂肪酸和各种气体，其中最明显的是氢气。每100ml牛奶含有4-6g乳糖，但由于其提供非常丰富的钙源和维生素C源，因此非常需要无乳糖牛奶和牛奶制品。这些产品含有少于0.25g乳糖/100ml牛奶并且通过用乳糖酶(β-半乳糖苷酶)将乳糖水解为其两种单体，半乳糖和葡萄糖来制造。β-半乳糖苷酶的水解反应。乳糖被水解成半乳糖和葡萄糖但是，消费者通常认为与普通牛奶相比，无乳糖牛奶不具有令人满意的口感。这可能是因为乳糖被水解为半乳糖和葡萄糖而使得无乳糖牛奶的甜度升高。乳糖具有相对较低的甜度和溶解度，而半乳糖和葡萄糖则甜得多，使得无乳糖牛奶比普通牛奶要甜得多。因此，需要制备无乳糖牛奶的替代方法。
技术实现思路
根据本专利技术的第一个实施方式，提供了蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其包含在其上固定结合乳糖的蛋白质的磁性纳米颗粒。结合乳糖的蛋白质可以是β-半乳糖苷酶，例如来自大肠杆菌。蛋白质功能化的磁性纳米颗粒可以能够结合溶液，比如牛奶或乳制品中存在的乳糖。蛋白质功能化的磁性纳米颗粒可以能够从溶液磁力分离。β-半乳糖苷酶可以含有使β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性相对于所述野生型β-半乳糖苷酶降低的至少一个突变。突变可以为E357D突变或降低酶的乳糖水解活性而不降低其乳糖结合能力的任何其他突变。结合乳糖的蛋白质可以在N-端或C-端处或在N-端或C-端附近具有亲和性标签。亲和性标签可以选自由多聚组氨酸标签(His-tag)、谷氨酰胺转氨酶、谷胱甘肽S-转移酶、FLAG、生物素、结合麦芽糖的蛋白质、糖蛋白和半胱氨酸介导的定点突变产物组成的组。磁性纳米颗粒可以具有涂层。结合乳糖的蛋白质可以通过选自由下述组成的组中的至少一种键或相互作用固定在磁性纳米颗粒上：共价键、静电相互作用、配位键、离子键、疏水相互作用、亲和键(affinity link)、亲水相互作用。根据本专利技术的第二个实施方式，提供了从包含乳糖的溶液分离乳糖的方法，该方法包括下述步骤：向溶液添加其上固定结合乳糖的蛋白质的磁性纳米颗粒；使磁性纳米颗粒上的蛋白结合溶液中的乳糖；以及从溶液去除磁性纳米颗粒。该方法通过去除乳糖，可使得溶液的甜度基本上不升高或下降。根据本专利技术的第三个实施方式，提供了制备如上所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒的方法，该方法包括下述步骤：i.将结合乳糖的蛋白质固定在磁性纳米颗粒上；以及ii.在固定结合乳糖的蛋白质之前或之后，稳定或保护磁性纳米颗粒。可将结合乳糖的蛋白质随机固定在磁性纳米颗粒上，例如，通过吸附或化学反应，或者通过定向固定，将结合乳糖的蛋白质以受控方式固定在磁性纳米颗粒上，例如，通过固定的金属亲和层析(IMAC)。在蛋白质和磁性纳米颗粒之间可以产生共价或非共价相互作用。根据本专利技术的第四个实施方式，提供了与普通乳制品相比具有降低的乳糖含量的乳制品，其中通过基本如上文所述的方法从该乳制品中已经去除了乳糖。附图说明图1：结合麦芽糖的蛋白质(MBP)的3D结构。MBP具有通过铰链区连接的两个结构域，该铰链区使得其能够在打开(无配体)和闭合(配体结合)构象之间移动(1)。图2：TAE缓冲液中1.2％琼脂糖凝胶分析。泳道1和泳道9含有未消化的pMalc2质粒。泳道2含有BgIII的单一限制酶消化产物。泳道3和泳道6含有HindIII的单一限制酶消化产物。泳道5和泳道7含有BgIII和HindIII的双重限制酶消化产物，以验证pMalc2质粒的存在。泳道4含有1kb DNA梯状条带。图3：表示MBP表达的SCS-PAGE凝胶(A)和蛋白质印记(B)分析，泳道1含有kaleidoscopeTM分子量标志物。泳道2含有MBP。泳道3和泳道4分别含有诱导的沉淀和上清液。泳道5和泳道6分别含有诱导的上清液和沉淀。图4：直链淀粉树脂上的亲和层析。峰值A表示非特异性蛋白质的洗脱，而峰值B表示MBP的洗脱。图5：亲和层析纯化的馏分的分析。A:SDS PAGE,B:蛋白质印记。泳道1含有KaleidoscopeTM分子量标志物。泳道2和泳道3分别含有诱导的上清液和沉淀。泳道4和泳道5含有纯化的馏分。图6：MNP上MBP固定的SDS-PAGE分析。泳道1含有KaleidoscopeTM分子量标志物。泳道2含有纯化的MBP。泳道3和泳道7分别含有fluidMAG-Q和fluidMAG-DXS MNP。泳道4和泳道8分别含有fluidMAG-Q-MBP复合物和fluidMAG-DXS-MBP复合物。泳道5和泳道9分别含有来自其的MBP用于fluidMAG-Q-MBP和fluidMAG-DXS-MBP复合物固定的溶液。泳道6和泳道10分别含有针对fluidMAG-Q-MBP和fluidMAG-DXS复合物的洗涤梯度。图7：针对还原糖的定量本尼迪特(benedict)测试的微孔板图像。本尼迪特试剂从蓝色变成橙色沉淀。A行和B行表示以1mM重复增量从0至1mM的标准曲线。C行和D行表示麦芽糖结合试验。图8：由对应于图4.8的A行和B行的定量本尼迪特测试产生的麦芽糖标准曲线。(n＝3±SEM)。图9：表示利用针对fluidMAG-Q-MBP和fluidMAG-DXS-MBP复合物离子固定在MNP上的MBP从溶液去除的麦芽糖的浓度的图表。fluidMAG-Q-MBP复合物能够从溶液去除大部分麦芽糖，3.4mg麦芽糖/0.2mg MBP功能化的MNP。(n＝3±SEM)。图10：pTrcHis-lacZ质粒图谱，其显示了lacZ基因的定位(红色)以及BamHI和EcoRI的限制性位点。BamHI被并入lacZ基因的3’端，用于RE消化和菌落选择。图11：显示出lacZ基因的PCR扩增(A)和克隆产物的RE消化(B)的琼脂糖凝胶。凝胶A；泳道1：Promega 1kB DNA标志物。泳道2：PCR扩增的LacZ基因。凝胶B；泳道3：Promega 1kB DNA标志物，泳道4：BamHI消化的pTrcHis-lacZ，泳道5：EcoRI消化的pTrcHis-lacZ。图12：表示lacZ基因的突变反应的TAE缓冲液中的琼脂糖凝胶。泳道1：1kb DNA梯状条带(Promega)，泳道2：7483bp突变反应产物。图13：pTrcHis-lacZ质粒的部分核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。在2139位的核苷酸表示pTrcHis-lacZ质粒中存在的E537D突变的位置。图14：表达的野生型和E537D突变体β-gal的SDS-PAGE凝胶。泳道1：KaleidoscopeTM分子量标志物，泳道2：β-gal标准品(Sigma)，泳道3：野生型诱导的上清液，泳道4：野生型诱导的沉淀，野生型未诱导的上清液，泳道6：野生型未诱导的沉淀，泳道7：E537D突变体诱导的上清液，泳道8：E537D突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，所述蛋白质功能化的磁性纳米颗粒包含其上固定有结合乳糖的蛋白质的磁性纳米颗粒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.27 ZA 2014/006331.一种蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，所述蛋白质功能化的磁性纳米颗粒包含其上固定有结合乳糖的蛋白质的磁性纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其中所述结合乳糖的蛋白质为β-半乳糖苷酶。3.根据权利要求2所述的蛋白功能化的磁性纳米颗粒，其中所述β-半乳糖苷酶为大肠杆菌β-半乳糖苷酶。4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其能够结合溶液中存在的乳糖。5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其能够从溶液磁力分离。6.根据权利要求2至5中任一项所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其中所述β-半乳糖苷酶含有至少一个突变，所述突变使所述β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性相对于野生型β-半乳糖苷酶下降。7.根据权利要求6所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其中所述突变为E357D突变。8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其中所述结合乳糖的蛋白质在N-端或C-端或在N-端或C-端附近含有亲和性标签。9.根据权利要求8所述的蛋白质功能化的磁性纳米颗粒，其中所述亲和性标签选自由下述组成的组：多聚组氨酸标签(His-tag)、谷氨酰胺转氨酶、谷胱甘肽S-转移酶、FLAG、生物素、结合麦芽糖的蛋白质、糖蛋白和半胱氨酸介导的定点突变产...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·多德，L·克卢姆珀曼，P·斯瓦特，
申请(专利权)人：斯坦陵布什大学，
类型：发明
国别省市：南非;ZA