一种心肌修复用bFGF缓释明胶-聚乙二醇复合凝胶膜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种心肌修复用bFGF缓释明胶-聚乙二醇复合凝胶膜的制备方法，将明胶溶液、聚乙二醇溶液混合，用戊二醛溶液交联，之后用0.1M甘氨酸和纯净水清洗，得到明胶-聚乙二醇复合水凝胶，在冷冻干燥后得到明胶-聚乙二醇复合凝胶膜，然后使用bFGF溶液浸泡该膜，植入体内受损心肌组织后此复合膜可长期、稳定地缓释bFGF，促进心肌组织功能恢复。本发明专利技术操作简单，成本低，bFGF可静电吸附在明胶分子上，随着凝胶膜的降解而得到缓释，聚乙二醇的添加显著延缓了凝胶膜的体内降解速率，从而进一步延长了生长因子缓释的时间，并稳定了因子释放水平。本发明专利技术将在再生医学领域中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及再生医学领域，具体涉及一种心肌修复用bFGF缓释明胶-聚乙二醇复合凝胶膜的制备方法。
技术介绍
体内心肌组织损伤后，受损部位局部微环境发生很大变化，细胞外基质结构和成分改变，并出现了炎性因子，这大大降低了细胞移植的治疗效果，如何改善受损部位微环境是提高治疗效果的关键。心肌受损局部微环境中缺乏正常三维细胞外基质结构和成分，这一方面导致受损部位缺乏有效的力学支撑和功能调控，另一方面使得植入细胞直接接触氧张力、自由基和炎性细胞因子刺激，加剧了细胞死亡。三维水凝胶近似于体内心肌组织细胞外基质三维网络，其基质刚度和成分可控，植入体内后一方面可以给受损心肌组织提供足够的支撑，另一方面可以给植入细胞提供保护，提高细胞治疗效果。此外，受损部位炎性微环境中还缺少促进组织再生、提高植入细胞生存的营养因子，研究表明，bFGF对细胞抵抗炎性因子作用有重要作用，并且能加速创伤愈合、促进组织再生。然而，单独注射bFGF半衰期短，容易降解，不易停留在受损部位。发展可缓释因子的三维水凝胶有利于维持因子的局部高浓度，促进组织修复。明胶是胶原水解的产物，和戊二醛能够交联形成凝胶膜，具有和在体细胞外基质相似的物理和生物学活性，美国FDA已经批准明胶进入体内，因此明胶膜在组织修复上具有较大的应用前景。研究发现，酸性明胶能够和bFGF等带正电荷的因子发生静电吸附，从而使得因子可吸附在明胶膜上，随着体内降解，因子被逐渐释放出来。然而，目前的明胶膜在体内降解速率较快，与组织修复不匹配，一般在3周左右降解完，而心肌等组织修复则需要更长时间，另外，明胶膜中因子释放的速率也不稳定。因此，需要对明胶膜进行进一步的修饰以解决其降解速度快、因子释放不稳定的问题。大分子之间的相互作用可能是一种简单、有效的方法，即选取一种安全、无毒的高分子，它和明胶存在大分子相互作用，从而使得经戊二醛交联的明胶膜更为稳定，降解速率得到降低，因子释放更为稳定。聚乙二醇(PEG)是环氧乙烷水解后的聚合物，无毒、无刺激性，广泛应用于各种药物制剂中，美国FDA批准其可以进入体内，并且其和明胶存在氢键相互作用，使用它一方面可以对明胶膜的物理特性进行调控，另一方面可改善其降解和因子缓释问题。PEG的分子量、PEG使用浓度以及bFGF与凝胶膜的孵育条件等都将影响膜的降解和因子的缓释，因此如何制备明胶-PEG复合凝胶膜以及获得较优的制备参数是急需解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种心肌修复用bFGF缓释明胶-聚乙二醇复合凝胶膜的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：将明胶溶液、聚乙二醇溶液混合，用戊二醛溶液交联，之后用0.1M甘氨酸和纯净水清洗，得到明胶-聚乙二醇复合水凝胶，在冷冻干燥后得到明胶-聚乙二醇复合凝胶膜，然后用生长因子bFGF溶液浸泡该膜，植入体内受损心肌组织后，此复合膜可缓释bFGF，促进心肌组织功能恢复。所述明胶为酸性明胶(typeB)，分子量为30-100kDa；明胶溶液的浓度为10-15％(W/V)，单位为g/mL。所述聚乙二醇分子量为6-20kDa；聚乙二醇溶液的浓度为5-10％(W/V)，单位为g/mL。所述戊二醛溶液浓度为1％(W/V)，单位为g/mL；戊二醛溶液交联的条件为4℃条件下反应12小时。所述明胶-聚乙二醇复合水凝胶中明胶终浓度为3-10％(W/V)，单位为g/mL，聚乙二醇终浓度为1-6％(W/V)，单位为g/mL，戊二醛终浓度为0.02-0.4％(W/V)，单位为g/mL。所述bFGF溶液的浓度为10mg/mL。所述生长因子溶液浸泡为4℃条件下每毫克凝胶膜使用3.3微升生长因子溶液浸泡12小时。所述的冷冻干燥条件为在冷冻干燥机中进行冷冻干燥，温度为-50度，时间为48小时。本专利技术操作简单，成本低，bFGF可静电吸附在明胶分子上，随着凝胶膜的降解而得到缓释，聚乙二醇的添加显著延缓了凝胶膜的体内降解速率，从而进一步延长了生长因子缓释的时间，并稳定了因子释放水平。附图说明图1高浓度PEG组、中浓度PEG组、低浓度PEG组及无PEG组凝胶膜动物模型体内降解情况；图2高浓度PEG组、中浓度PEG组、低浓度PEG组及无PEG组凝胶膜中残留的放射性标记的bFGF的放射性强度；图3高浓度PEG组、中浓度PEG组、低浓度PEG组、无PEG组及无凝胶膜组心肌组织切片缺血面积统计；图4高分子量PEG组、中分子量PEG组、低分子量PEG组凝胶膜的体内降解；图5高分子量PEG组、中分子量PEG组、低分子量PEG组凝胶膜的体内bFGF缓释；具体实施方式实施例1：bFGF缓释明胶-聚乙二醇复合凝胶膜促进受损心肌组织修复将分子量为100kDa酸性明胶配制成15％(W/V)的水溶液(单位为g/mL)，将分子量为20kDa的聚乙二醇配成10％(W/V)的水溶液，戊二醛溶液稀释为1％(W/V)(单位为g/mL)。首先，将明胶及聚乙二醇溶液混合均匀，再加入戊二醛溶液，三种物质的终浓度为10％(W/V)、2％(W/V)及0.3％(W/V)(单位均为g/mL)，并在4℃条件下交联12小时。之后，使用0.1M甘氨酸和纯净水清洗，并使用冷冻干燥机(温度-50度，时间48小时)冷冻干燥后得到明胶-PEG复合凝胶膜。将放射性元素标记的bFGF配制成10mg/mL的溶液，并在4℃条件下使用20μl生长因子溶液浸没6mg凝胶膜，反应12小时，使得因子吸附在复合膜上。将第4代大鼠心肌干细胞注射到缺血性心肌损伤大鼠模型的受损组织部位(细胞注射量为4×106个细胞/鼠)，之后将含有bFGF的复合凝胶膜覆盖在受损部位表面，缝合，作为高浓度PEG组。同时设置无PEG组、低浓度PEG组(0.5％)及中浓度PEG组(1％)组作为对照组(每个浓度的实验有15只鼠)。在第1、2、3、4、5周处死动物，(每周处死3只)，称量剩余的凝胶膜的重量、检测膜中残留的放射性因子的辐射强度，并在第5周进行心肌组织免疫组化，以表征凝胶膜体内降解、因子缓释以及心肌组织缺血面积情况。实验结果发现，含有PEG的复合膜的降解速率均比无PEG的明胶膜低，bFGF缓释更为平缓，尤其是高、中浓度PEG组效果尤其理想，而低浓度PEG组效果不显著(图1、2)。此外，心肌组织切片免疫组化定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌修复用bFGF缓释明胶‑聚乙二醇复合凝胶膜的制备方法，其特征在于：将明胶溶液、聚乙二醇溶液混合，用戊二醛溶液交联，之后用0.1M甘氨酸和纯净水清洗，得到明胶‑聚乙二醇复合水凝胶，在冷冻干燥后得到明胶‑聚乙二醇复合凝胶膜，然后用生长因子bFGF溶液浸泡该膜，植入体内受损心肌组织后，此复合膜可缓释bFGF，促进心肌组织功能恢复。

【技术特征摘要】
1.一种心肌修复用bFGF缓释明胶-聚乙二醇复合凝胶膜的制备
方法，其特征在于：将明胶溶液、聚乙二醇溶液混合，用戊二醛溶液
交联，之后用0.1M甘氨酸和纯净水清洗，得到明胶-聚乙二醇复合水
凝胶，在冷冻干燥后得到明胶-聚乙二醇复合凝胶膜，然后用生长因
子bFGF溶液浸泡该膜，植入体内受损心肌组织后，此复合膜可缓释
bFGF，促进心肌组织功能恢复。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述明胶为酸性明胶(typeB)，分子量为30-100kDa；明胶溶液
的浓度为10-15％(W/V)，单位为g/mL。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述聚乙二醇分子量为6-20kDa；聚乙二醇溶液的浓度为5-10％
(W/V)，单位为g/mL。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马小军，刘洋，孙广炜，周楠，廖捍斯，孙东升，王淑君，肖晶，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21