本发明专利技术提供了一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，包括如下步骤：金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液的制备；水溶性碲化镉量子点溶液和水溶性硫化铅量子点溶液的制备；单分散硅烷化SiO2纳米粒子水分散液的制备；碲化镉量子点包覆的SiO2纳米球分散液和硫化铅量子点包覆的SiO2纳米球分散液的制备；MB-aptamer1和MB-aptamer2捕获探针的制备；适配体1的互补链与SiO2@PbS偶联得到cDNA1-SiO2@PbS以及适配体2的互补链与SiO2@CdTe偶联得到cDNA2-SiO2@CdTe纳米生物探针的制备；MB-aptamer1/DNA1-SiO2@PbS和MB-aptamer2/DNA2-SiO2@CdTe纳米生物复合材料的制备；传感器的构建及样品的检测。本发明专利技术使用的丝网印刷电极结构简单，加工方法简便、成本低，具有检测方法操作方便、检测灵敏度高等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学检测领域，特指一种同时检测两种霉菌毒素的磁控电化学适配体传感器的构建方法及用途。
技术介绍
赫曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是由赫曲霉(Aspergillusochraceus)和纯绿青霉(Penicilliumviridicatum)产生的一种霉菌肾毒素，属于典型的食源性真菌毒素。在极性有机溶剂中0ΤΑ能稳定存在，如0ΤΑ的乙醇溶液在冷藏条件下可稳定存在一年以上，但0ΤΑ在紫外线照射下很快就会分解。在动物体内0ΤΑ非常稳定、不易被代谢降解，而且0ΤΑ在多种动物体内存在毒性，研究发现其毒性主要表现肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。1993年，0ΤΑ被国际癌症研究机构定为2B类致癌物。0ΤΑ的产生主要来源于0ΤΑ产生菌，这些霉菌在粮谷类、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、中草药、调味品、罐头食品、油、橄榄、豆制品、啤酒、茶叶等多种农副产品的生产、加工过程中都有可能出现。另一方面，动物在进食受到0ΤΑ污染的饲料后，会因0ΤΑ的不易代谢降解而在体内蓄积。人在食用这些被0ΤΑ污染的动物组织后，对人的生命安全将会产生潜在的危害。伏马毒素(Fumonisin，FB)是由镰刀菌属在一定的温度和湿度下产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。随后，Laurent等又从伏马毒素中分离出伏马毒素Bl (FBI)和伏马毒素B2(FB2)。到目前为止，发现的伏马毒素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4 和 FP1 共 11 种，其中 60% 以上是 FB1，其毒性也最强。伏马毒素在人畜体内的作用比较复杂，它与神经鞘氨醇(Sphinngosine，SO)和二氢神经鞘氨醇(Shpinganine，SA)的结构极为相似，而后两者均为神经鞘脂类的长链骨架。伏马毒素通过抑制N-脂酰基神经鞘氨醇合成酶，阻断S0合成，破坏鞘脂类的代谢或影响鞘脂类的功能，这一抑制可引起SA升高，从而导致组织、血、尿中SA/S0比值升高。细胞内自由SA的聚集是有毒性的，而内源神经酰胺和1-磷酸-鞘氨醇之间是否平衡也决定了细胞能否存活。现在认为SA浓度和SA/S0比值是我们调查研究过的所有动物是否存在FBI接触感染最敏感的生物标记，两者之间存在着剂量依赖性。伏马毒素可以引起人畜急性中毒和慢性毒性，并具有种属特异性和器官特异性，不同的动物产生的疾病不同，相应的耐受限量也有很大差别。研究发现高浓度的FBI可导致各种家畜和试验动物出现种属特异性的急毒症状，如马脑白质软化综合征、猪肺水肿和羊肝肾病变等，现在还发现FBI可能与人的食管癌和肝癌发生有关，但低剂量的FBI对小鼠和猪均无明显影响。动物食用了含有0ΤΑ和FBI等真菌毒素的饲料会导致体内毒素残留从而使肉制品被污染，这些残留的0ΤΑ和FBI真菌毒素也可以经由食物链进入人体，从而对人类健康及农业经济发展造成严重威胁。因此，探寻有效检测、控制真菌毒素的措施对于生产效益、动物福利、产品质量和食品安全都是至关重要的。美国、欧洲等发达国家已经初步确立了真菌毒素检测的法规和标准。例如，食品法典委员会规定了小麦、大麦、黑麦等谷物及其产品的OTA限量标准为5.0 μ g/kg。欧盟委员会对谷物产品、葡萄酒等食品的0TA限量标准更为严格，要求谷物产品中的0TA彡3.0 μ g/kg，葡萄酒中的0TA彡2.0 μ g/kg。对于伏马毒素的研究很多，但对其制定限量标准的很少。2001年6月美国食品与药物管理局(FDA)规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为2mg/kg。用于0ΤΑ和FBI等真菌毒素的传统检测方法主要依靠(1)理化检测方法，如薄层色谱法(TLC)，微柱层析法，气相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)，毛细管电泳法(CE)等；⑵生物学检测法，包括皮肤毒性实验，致呕吐实验，种子发芽实验等；⑶免疫化学检测方法，如酶联免疫吸附分析法，荧光免疫分析法，放射免疫分析法等。尽管这些方法一般可以较为灵敏地确定样品中真菌毒素的含量，但往往存在许多不足，例如，(1)需要大型昂贵仪器，如气相/液相色谱仪，质谱仪等；样品前处理步骤麻烦耗时；(2)样品消耗量大，操作步骤繁琐；分析过程中易产生大量废弃的有机溶剂，污染环境；(3)需要相对专业化的实验人员；(4)检测成本较高，不便于广泛推广。现实中粮食往往同时受多种真菌毒素污染，虽然真菌毒素多残留问题已引起重视，但是近年来研究的热点集中于真菌毒素的单一检测，鲜有同时检测多种真菌毒素的研究报道。因此，发展一种简便快捷，高通量，无需大型仪器，检测成本低的方法用于食品中多种真菌毒素的检测，对于人类健康和社会发展都大有益处。本专利技术首先成功合成了含有两种不同金属元素的量子点(CdTe QDs和PbS QDs)并将其包覆在3;[02微球表面，以金(Au)壳包覆的磁性纳米粒子为载体，基于核酸适配体与其互补链碱基互补配对技术组装了磁性纳米复合材料作为生物探针，藉以核酸适配体为识别元件用于0ΤΑ和FBI的电化学方波伏安法(SWV)检测，构建了一种快速、灵敏可同时检测0ΤΑ和FBI的电化学磁控适配体传感器，建立了 0ΤΑ和FBI标准品浓度与两种金属离子之间的对应关系，实现了简单、灵敏、同时快速检测0ΤΑ和FBI两种典型真菌毒素的目的。
技术实现思路
本专利技术旨在专利技术一种高通量、高选择性、简单易操作、成本低廉等优点为一体的磁控电化学适配体传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的同时定量检测两种真菌毒素0ΤΑ和FBI的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低、易干扰、检测单一的难题。所采用的方案概括为:以金纳米粒子包覆的Fe304磁性微球(MB)为载体分别负载经巯基修饰的伏马毒素Bl (FBI)的适配体1 (aptamerl)和赭曲霉毒素A(OTA)的适配体2 (aptamer2)，得到MB-aptamerl和MB_aptamer2。以娃烧化的Si02纳米微球为载体分别负载上巯基丙酸(MPA)保护的PbS量子点(QDs)和CdTe QDs，得到Si02@PbS和Si02@CdTe纳米粒子，进而将氨基末端修饰的aptamerl和aptamer2的互补链cDNAl和cDNA2分别偶联到 Si02@PbS 和 Si02@CdTe 纳米粒子表面，得到 cDNAl_Si02@PbS 和 cDNA2_Si02@CdTe 两种纳米粒子标记的纳米生物探针，通过碱基互补配对反应分别将cDNAl-Si02@PbS、cDNA2-Si02iCdTe 和 MB-aptamerl、MB_aptamer2 进行杂交，得到 MB-aptamerl/cDNAl-Si02@PbS 和MB-aptamer2/cDNA2-Si02iCdTe 两种生物复合物。将一定量的 MB-aptamerl/cDNAl-Si02@PbS和MB-aptamer2/cDNA2-Si02@CdTe混合后，将其与不同浓度的0ΤΑ和FBI标准品进行同时温育。经磁分离后，将收集得到的磁性纳米复合物用一定量的稀硝酸溶解得到含Pb2+和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液的制备；步骤2、水溶性碲化镉量子点溶液和水溶性硫化铅量子点溶液的制备；步骤3、单分散硅烷化SiO2纳米粒子水分散液的制备；步骤4、CdTe QDs包覆的SiO2纳米球分散液和PbS QDs包覆的SiO2纳米球分散液的制备：取步骤2制备的CdTe QDs溶液、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺溶液、步骤3制备的SiO2纳米粒子水分散液混合均匀，在冰水浴中搅拌反应，反应结束后，将产物离心分离、洗涤，再将产物分散到蒸馏水中，备用；取步骤2制备的PbS QDs溶液、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺溶液、步骤3制备的SiO2纳米粒子水分散液混合均匀，在冰水浴中搅拌反应，反应结束后，将产物离心分离、洗涤，再将产物分散到蒸馏水中，备用；步骤5、MB‑aptamer1和MB‑aptamer2捕获探针的制备：包括用MB为载体负载经巯基修饰的伏马毒素B1的适配体1，简称为MB‑aptamer1；用MB为载体负载经巯基修饰的赭曲霉毒素A的适配体2，简称为MB‑aptamer2；具体如下：将aptamer1的Tris‑HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris‑HCl缓冲溶液混合，振荡反应，反应完毕后，离心后得到即时活化的aptamer1溶液A，将所述活化的aptamer1溶液A与步骤1得到的金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液混合，得到混合液B，向混合液B中加入6‑巯基己醇溶液得到混合液C，将混合液C进行振荡反应，反应完毕后，对产物进行磁性分离并洗涤，最后将产物重新分散到水中，备用；将aptamer2的Tris‑HCl缓冲溶液与含有磷酸三氯乙酯的Tris‑HCl缓冲溶液混合，振荡反应，反应完毕后，离心后得到即时活化的aptamer2溶液D，将所述即时活化的aptamer2溶液D与步骤1得到的金纳米粒子包覆的Fe3O4微球的水分散液混合，得到混合液E，向混合液E中加入6‑巯基己醇溶液得到混合液F，将混合液F进行振荡反应，反应完毕后，对产物进行磁性分离并洗涤，最后将产物重新分散到水中，备用；步骤6、适配体1的互补链与SiO2@PbS偶联得到cDNA1‑SiO2@PbS以及适配体2的互补链与SiO2@CdTe偶联得到cDNA2‑SiO2@CdTe纳米生物探针的制备：取步骤4制备的CdTeQDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的Tris‑HCl缓冲溶液混合，得到混合液G，将混合液G在室温下搅拌反应a，加入溶有适配体1的互补链的Tris‑HCl缓冲溶液，得到混合液H，室温下进行搅拌反应b，反应完毕后离心得到产物，并将产物重新用Tris‑HCl缓冲溶液分散，备用；取步骤4制备的PbS QDs包覆的SiO2纳米球的水分散液与含有1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的Tris‑HCl缓冲溶液混合，得到混合液I，将混合液I在室温下搅拌反应c，加入溶有适配体2的互补链的Tris‑HCl缓冲溶液，得到混合液J，对混合液J进行室温下搅拌反应d，反应完毕后离心得到产物，并将产物重新用Tris‑HCl缓冲溶液分散，备用；步骤7、MB‑aptamer1/DNA1‑SiO2@PbS和MB‑aptamer2/DNA2‑SiO2@CdTe纳米生物复合材料的制备：取步骤6制得的cDNA1‑SiO2@PbS分散液与步骤5制得的MB‑aptamer1分散液混合，得到混合液K，室温下振荡反应，反应完毕后磁性分离产物并洗涤，最后将产物重新分散于Tris‑HCl缓冲液中，备用；取步骤6制得的cDNA2‑SiO2@CdTe分散液与步骤5制得的MB‑aptamer2分散液混合，得到混合液L，室温下振荡反应，反应完毕后磁性分离产物并洗涤，最后将产物重新分散于Tris‑HCl缓冲液中，备用；步骤8、传感器的构建及样品的检测，包括：铋膜修饰的丝网印刷电极的制备：将与电化学工作站连接的丝网印刷电极浸入硝酸铋溶液中，通过外加电压e沉积Bi3+，沉积完毕后，洗涤并干燥，铋膜修饰的丝网印刷电极；对OTA和FB1标准品进行检测，建立标准曲线：将FB1和OTA标准品溶液分别与含有MB‑aptamer1/DNA1‑SiO2@PbS和MB‑aptamer2/DNA2‑SiO2@CdTe的混合液反应，室温下温育，反应完毕后用磁铁收集反应后的磁性复合材料，用PBS冲洗后用含有PBS和HNO3的混合溶液稀释得到底液；将工作站相联的铋膜修饰的丝网印刷电极浸入含底液和HAc‑NaAc缓冲溶液的混合溶液中，在外加电压f下沉积Cd和Pb金属单质，然后利用方波伏安法检测Cd2+和Pb2+的溶出峰...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王成全，钱静，王坤，黄星奕，华梦娟，刘倩，郝楠，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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